GPERshRNA表達載體的構建及其對血管內皮細胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　 構建人和小鼠共用的G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G-protein-coupled receptor30，GPER)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表達質粒，鑒定其對人血管內皮細胞(Human vascular endothelial cells，HVECs)和小鼠血管內皮細胞(mouse vascular endothelial cells，MVECs)GPER表達的影響，并觀察其對人與

2、小鼠血管內皮細胞增殖的影響。
　　 方法：
　　 設計并體外合成靶向(人和小鼠)基因GPER的特異性編碼短發(fā)卡RNA(short hair RNA，shRNA)序列的寡核苷酸，同時合成一對錯義的非特異性序列作為陰性對照，退火，連接到經限制性核酸內切酶BglⅡ；HindⅢ酶切處理的線性化pSUPER質粒中，轉化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆，抽提重組質粒，進行EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切電泳及測序鑒定，構建shRNA重組質粒

3、；培養(yǎng)人與小鼠的血管內皮細胞(vascular endothelial cells，ECs)，進而將構建的三組重組質粒用脂質體法分別轉染人和小鼠的血管內皮細胞，蛋白質印跡(Western blot)檢測各組GPER蛋白水平的表達，用MTT法檢測構建重組質粒對人血管內皮細胞及小鼠血管內皮細胞增殖的影響。
　　 結果：
　　 GPER shRNA重組質粒經酶切及測序分析表明：目的核苷酸序列成功插入了預計位點且序列完全一致；<

4、br>　　 轉染了GPER shRNA質粒的人血管內皮細胞和小鼠血管內皮細胞，與對照組相比均可下調GPER蛋白的表達(P<0.05)，其中GPER shRNA2質粒的抑制作用較強，轉染48 h后GPER蛋白的抑制率可最高可達到84.2％；
　　 構建的重組質粒轉染人與小鼠血管內皮細胞后，可顯著抑制(人與小鼠)血管內皮細胞的增殖。
　　 結論：
　　 成功構建同時靶向人和小鼠GPER的RNA干擾重組載體；構建成功