副豬嗜血桿菌和豬支氣管敗血波氏桿菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)和豬支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica, Bb)是引起豬發(fā)生呼吸道綜合征(PRDC)的重要致病因子。機(jī)體在各種應(yīng)激因素的影響下或感染導(dǎo)致免疫力下降的病毒性疾病時(shí)，均易導(dǎo)致Hps和Bb的感染率大大增加。這兩種病原菌混合感染情況十分普遍，且都易引起豬呼吸道隱性感染及急、慢性炎癥，臨床癥狀相似不易區(qū)分，給臨床診斷和防治帶來(lái)困難。本研究依據(jù)Hps

2、OMP P2基因和Bb DNT基因成功建立了一種快速、簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)和靈敏的可同時(shí)檢測(cè)具有毒力的副豬嗜血桿菌和豬支氣管敗血波氏桿菌的診斷方法。通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，建立的雙重PCR法特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好，并成功應(yīng)用于臨床實(shí)踐。
　　1.雙重PCR方法的建立
　　依據(jù)Hps OMP P2和Bb DNT基因序列各設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并對(duì)引物進(jìn)行二聚體、同源性、互補(bǔ)性分析，試驗(yàn)預(yù)計(jì)分別能擴(kuò)增出748 bp和344 bp的DNA片段。利用設(shè)計(jì)

3、的引物分別對(duì)Hps OMP P2基因和Bb DNT基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在單一PCR基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化雙重PCR的反應(yīng)條件，包括引物濃度、退火溫度、延伸時(shí)間、dNTPs濃度、rTaq DNA polymerase濃度和鎂離子濃度的優(yōu)化。最終確立雙重PCR最佳試劑組分（25μL反應(yīng)體系）為:10×PCRBuffer(Mg2+ free)2.5μL,rTaq DNA Polymerase0.3μL,25mM MgC122μL,dNTP Mix

4、ture2μL，Hps-F和Hps-R各0.8μL，Bb-F和Bb-R各0.5μL，模板2μL，加ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min;95℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min，4℃保存。用建立的雙重PCR方法對(duì)各血清型Hps和Bb進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果毒力菌株可檢測(cè)出，而非毒力菌株不能檢測(cè)出，表明本方法適用于對(duì)具有毒力的Hps和Bb進(jìn)行快速診斷。特異試驗(yàn)結(jié)果顯示

5、:本方法只能檢測(cè)出Hps和Bb，而對(duì)肺炎支原體、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎沙門氏菌、豬鏈球菌和大腸桿菌不能檢測(cè)出;敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明該方法能檢測(cè)出Hps和Bb的最低核酸濃度分別達(dá)到1.79×10-3μg/μL及8.3×10-3μg/μL;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果一致。說(shuō)明該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好。
　　2.雙重PCR方法與其他檢測(cè)方法效果比較
　　用建立的雙重PCR對(duì)來(lái)自四川部分地區(qū)的36份PRDC病料進(jìn)行

6、檢測(cè)并與單一PCR和細(xì)菌分離作比較，結(jié)果顯示，Hps和Bb的陽(yáng)性檢出率分別是33.33％和5.56％。雙重PCR與細(xì)菌分離陽(yáng)性符合率分別為83.33％和50％，雙重PCR與單一PCR陽(yáng)性符合率達(dá)到100％。結(jié)果說(shuō)明雙重PCR具有與單一PCR相同的敏感性，并且其敏感性高于細(xì)菌分離。
　　3.雙重PCR方法的臨床應(yīng)用
　　用本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法對(duì)來(lái)自四川部分地區(qū)的120份PRDC病料進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，肺組織是Hps和

7、Bb檢出率最高的部位;感染Hps的病料有38份，感染Bb的病料有17份，統(tǒng)計(jì)出Hps和Bb的陽(yáng)性檢出率分別是31.67％、14.17％。5份檢出為Hps和Bb的混合感染，混合感染率為4.17％;本方法同樣適用于對(duì)菌落和組織樣品的檢測(cè)。本研究通過(guò)分別對(duì)不同地區(qū)、不同季節(jié)、不同日齡Hps和Bb的感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，從不同地區(qū)感染情況來(lái)看，Hps在四川地區(qū)已普遍存在，Bb呈散在性分布，并且兩種病原菌在四川地區(qū)均形成一定的流行趨勢(shì)，從不同季