副豬嗜血桿菌重組蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立及亞單位疫苗候選因子的篩選.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是一種非溶血性的、NAD依賴的、形態(tài)多為球桿狀和棒桿狀的細(xì)小革蘭氏陰性菌。該菌是豬Glasser's病的病原，該病以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征。副豬嗜血桿菌的感染能夠引發(fā)豬群的高致病率和死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，已經(jīng)鑒定出了15種不同毒力的血清型，但仍有很大一部分分離株不能分型。由于不同菌株的毒力不同以及宿主自身免疫力的差異，急

2、性和慢性病例所表現(xiàn)的臨床癥狀也有所不同。這給副豬嗜血桿菌病的診斷和防控帶來(lái)了很大困難。
　　本實(shí)驗(yàn)室在完成了對(duì)ZJ0906（12型）副豬嗜血桿菌全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)AH1108（4型）、JS1023（5型）和ZJ0906（12型）三株副豬嗜血桿菌進(jìn)行了細(xì)菌蛋白組學(xué)分析。根據(jù)分析結(jié)果篩選出在不同血清型中穩(wěn)定表達(dá)的3種抗原，ELISA結(jié)果和動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)證明三個(gè)穩(wěn)定表達(dá)蛋白能夠檢測(cè)出不同血清型的副豬嗜血桿菌的感染，并對(duì)各個(gè)血清型的副

3、豬嗜血桿菌產(chǎn)生交叉保護(hù)力。具體研究如下:
　　1.副豬嗜血桿菌不同血清型穩(wěn)定表達(dá)蛋白的篩選及鑒定
　　以12型副豬嗜血桿菌菌株提取的DNA為模板擴(kuò)增了3種穩(wěn)定表達(dá)蛋白的基因，連入pET-28a(+)表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)的蛋白利用Ni-NTA親和層析樹(shù)脂進(jìn)行純化。之后通過(guò)免疫小鼠制備多克隆抗體，制備的多克隆抗體經(jīng)ProteinA親和層析樹(shù)脂純化。對(duì)3種血請(qǐng)型的副豬嗜血桿菌株進(jìn)行S

4、DS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至NC膜，以純化小鼠多抗為一抗，通過(guò)western-blot分析3種蛋白分別在3種血清型菌株中的表達(dá)量。結(jié)果顯示:表達(dá)純化后的3種穩(wěn)定蛋白濃度高、雜蛋白含量低，免疫小鼠后的抗體水平高，Western-blot顯示3種蛋白在3種血清型的副豬嗜血桿菌中表達(dá)量基本一致。這3種穩(wěn)定蛋白的表達(dá)為建立能夠檢測(cè)多種血清型的副豬嗜血軒菌ELISA方法及篩選具有交叉保護(hù)力的疫苗候選因子奠定了基礎(chǔ)。
　　2.副豬嗜血桿菌穩(wěn)

5、定表達(dá)蛋白間接ELISA檢測(cè)方法的建立及流行病學(xué)調(diào)查
　　以3種原核表達(dá)蛋白作為候選抗原和全菌裂解物同時(shí)包被酶標(biāo)板，對(duì)臨床豬血清進(jìn)行副豬嗜血桿菌抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以蛋白manganese-dependent superoxide dismutase(MnSOD)作為包被抗原得到的結(jié)果最接近用副豬嗜血桿菌全菌裂解物進(jìn)行ELISA檢測(cè)的結(jié)果，故確定以蛋白MnSOD為抗原建立間接ELISA方法。通過(guò)矩陣法確定ELISA最佳反應(yīng)條件:抗原包被

6、濃度為1.5μg/mL，4℃過(guò)夜;5％脫脂乳37℃封閉2h;待檢血清稀釋度為1∶160，37℃作用90min;酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶15000，37℃作用45min;底物顯色時(shí)間為37℃6min?？贵w臨界值OD450nm≥0.2451判為陽(yáng)性，OD450nm＜0.2083判為陰性，介于兩者之間為可疑。特異性和重復(fù)性試驗(yàn)證明，該方法與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬口蹄疫病毒、紅斑丹毒絲菌、馬鏈球菌、豬鏈球

7、菌、腸炎沙門氏菌血清抗體無(wú)交叉反應(yīng)。重復(fù)性試驗(yàn)證明批內(nèi)、批間重復(fù)性良好。建立的間接ELISA方法對(duì)114份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，與4、5、12型全菌裂解物ELISA檢測(cè)結(jié)果比較，陽(yáng)性符合率分別為80.77％、80.00％、90.00％，總陽(yáng)性符合率為90.63％。用建立的ELISA方法對(duì)來(lái)自8個(gè)不同?。▍^(qū)）的1610份豬血清進(jìn)行副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，總陽(yáng)性檢出率高達(dá)54.41％，其中江蘇地區(qū)最高，江西地區(qū)最低，且秋冬季節(jié)的陽(yáng)

8、性檢出率較高。證明該方法可用于4、5、12型副豬嗜血桿菌的抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
　　3.副豬嗜血桿菌重組亞單位疫苗候選因子的篩選
　　豬Glasser's病的病原體是副豬嗜血桿菌。目前，廣泛應(yīng)用商業(yè)化的死菌苗和自家苗來(lái)保護(hù)豬群。然而，副豬嗜血桿菌眾多的血清型使得疫苗的交叉保護(hù)力受到了限制。本研究選用了3種在4、5、12型副豬嗜血桿菌中穩(wěn)定表達(dá)的蛋白作為候選因子，應(yīng)用15A佐劑乳化蛋白，采用皮下注射免疫豚鼠，每?jī)芍苊庖咭淮?/p>

9、，共免疫兩次。通過(guò)ELISA方法測(cè)定豚鼠血清抗體效價(jià)。二免后第二周，用副豬嗜血桿菌不同毒力毒株AH1108（4型）、JS1023（5型）和ZJ0906（12型）進(jìn)行攻毒。結(jié)果顯示，所有試驗(yàn)組豚鼠的血清抗體效價(jià)均顯著高于陰性對(duì)照組。與此同時(shí)，通過(guò)SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)六種細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)組的細(xì)胞因子水平均顯著高于陰性對(duì)照組。攻毒試驗(yàn)中，蛋白CyaY對(duì)三株副豬嗜血桿菌AH1108（4型）、JS1023(5型)和ZJ0

10、906（12型）的保護(hù)率分別為60％、40％和80％;蛋白MnSOD對(duì)三株副豬嗜血桿菌AH1108（4型）、JS1023（5型）和ZJ0906（12型）的保護(hù)率為40％、40％和80％;蛋白GPD對(duì)三株副豬嗜血桿菌AH1108（4型）、JS1023（5型）和ZJ0906（12型）的保護(hù)率為60％、40％和80％。研究表明，3種穩(wěn)定表達(dá)的蛋白對(duì)于AH1108（4型）、JS1023（5型）和ZJ0906（12型）的感染有交叉保護(hù)力，有作為副