兔支氣管敗血波氏桿菌fimN基因的克隆表達(dá)及快速檢測(cè)方法的建立.pdf

1、兔支氣管敗血波氏桿菌病是由支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)引起的一種家兔呼吸道傳染病,常呈地方性流行,多為慢性,急性敗血性死亡較少。該病病程長(zhǎng),反復(fù)發(fā)生,難治愈,給養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的的經(jīng)濟(jì)損失。Bb的菌毛蛋白兼具毒力因子及免疫原的特性,其免疫原性已被證實(shí)。對(duì)fimN基因進(jìn)行克隆表達(dá)和免疫原性分析,以重組蛋白為檢測(cè)抗原建立間接ELISA診斷方法,為兔波氏桿菌臨床快速檢測(cè)和研制高效疫苗奠定良好的基

2、礎(chǔ)。
　　 本研究一共分為四部分內(nèi)容,第一部分采用PCR技術(shù)擴(kuò)增并克隆兔支氣管敗血波氏桿菌的fimN基因；第二部分以大腸桿菌原核pET-28a(+)為表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行fimN基因的表達(dá)、純化及表達(dá)蛋白免疫原性分析；第三部分是兔支氣管敗血波氏桿菌PCR檢測(cè)方法的建立；第四部分是兔支氣管敗血波氏桿菌間接ELISA診斷方法的建立。
　　 根據(jù)兔支氣管敗血波氏桿菌菌毛蛋白的fimN基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,擴(kuò)增出648bp的目的

3、基因片段,將產(chǎn)物與pMD-19T載體連接,陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定,結(jié)果表明,擴(kuò)增的fimN基因與參考序列同源性可高達(dá)99％,成功構(gòu)建了克隆載體。
　　 對(duì)pMD19T-fimN以及表達(dá)載體pET-28a(+)雙酶切,連接轉(zhuǎn)化后,獲得重組質(zhì)粒pETBb-fimN,雙酶切和序列鑒定結(jié)果表明目的基因的插入位置和方向正確,加入IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)得到的目的蛋白大小約為27KD,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,表

4、達(dá)的蛋白能與Bb全菌陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合,為后續(xù)的以重組fimN蛋白為包被抗原來(lái)建立間接ELISA快速診斷方法莫定基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)GenBank中支氣管敗血波氏桿菌fimN基因的短片段序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特反應(yīng),且檢出最低濃度為10pg,說(shuō)明該方法敏感性高,特異性強(qiáng),可用于臨床檢測(cè)。
　　 以表達(dá)并純化的fimN蛋白為包被抗原,用fimN蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔制備血清作為陽(yáng)性血清。優(yōu)化反應(yīng)條件,確定抗原和血清的最佳工作濃度,最佳封