鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌融合菌株的構(gòu)建及其雙重PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、本研究從浙江省主要養(yǎng)鴨地區(qū)分離到13株鴨疫里默氏桿菌和19株大腸桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明浙江省各地區(qū)鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌耐藥情況非常嚴(yán)重，其中鴨疫里默氏桿菌總體上對(duì)多粘菌素、卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、復(fù)方新諾明等藥物的耐藥性很嚴(yán)重；大腸桿菌的耐藥情況更為嚴(yán)重，大腸桿菌總體上對(duì)紅霉素、麥迪霉素、氟哌酸、氨芐青霉素、青霉素G、林可霉素、阿莫西林、鏈霉素等藥物的耐藥性很嚴(yán)重。鴨疫里默氏桿菌總體上可耐受6種抗生素，占抗生素種類的比例為31

2、.6％；大腸桿菌更是達(dá)到了總體上可耐受11種抗生素，占抗生素種類的比例為57.9％，如此嚴(yán)重的多重耐藥性必將給防治帶來很大的困難。 為發(fā)展細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)，探索研制細(xì)菌多聯(lián)菌苗的新方法、新途徑，本研究選用鴨疫里默氏桿菌和鴨大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型TXRA1和ZBO78進(jìn)行融合試驗(yàn)，并用氯霉素(Chl)、紅霉素(Ery)對(duì)其進(jìn)行抗藥性誘導(dǎo)培育出耐藥標(biāo)記菌株鴨疫里默氏桿菌TXRA1(chlr，Erys)和鴨大腸桿菌ZBO78(Ery

3、r，Chls)菌株。試驗(yàn)?zāi)康氖敲髟摼甑脑|(zhì)體制備和再生的條件并進(jìn)行優(yōu)化，培育雙價(jià)融合菌株為預(yù)防這兩種疾病提供新方法。 通過優(yōu)化Lysozyme-EDTA的工作時(shí)間和作用濃度，最后確定鴨疫里默氏桿菌TXRA1以Lysozyme0.1 g/L作用20 min后補(bǔ)加EDTA至終濃度為0.01mol/L繼續(xù)作用作用45 min為最佳試驗(yàn)條件，并成功獲得了92％的原生質(zhì)體制備率；鴨大腸桿菌ZBO78以Lysozyme0.2 g/L作

4、用20 min后補(bǔ)加EDTA至終濃度為0.01 mol/L繼續(xù)作用16 min為最佳試驗(yàn)條件，并成功獲得了91.94％的原生質(zhì)體制備率。通過進(jìn)一步優(yōu)化原生質(zhì)體的制備方式、高滲懸浮緩沖液以及高滲再生培養(yǎng)基中的蔗糖濃度、瓊脂濃度、pH值、離子濃度等因素，鴨疫里默氏桿菌TXRA1成功獲得了38.77％的原生質(zhì)體再生率；鴨大腸桿菌ZBO78成功獲得了37.29％的原生質(zhì)體再生率。 根據(jù)對(duì)鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌原生質(zhì)體的制備和再生條件的

5、優(yōu)化后的最佳條件，我們應(yīng)用PEG法成功地構(gòu)建了鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌雙型融合菌株，獲得了31株具有雙親菌株耐藥性的雙型融合菌株。鑒于試驗(yàn)所得到的31株融合子能夠發(fā)生自凝現(xiàn)象，本試驗(yàn)建立了基于兩親本菌株部分外膜蛋白(ompA)為靶基因的雙重PCR檢測(cè)方法，經(jīng)雙重PCR擴(kuò)增后其中有11株融合菌株能夠表達(dá)兩親本的ompA基因，有20株僅表達(dá)親本大腸桿菌的ompA基因，另外實(shí)驗(yàn)過程中加入Dnase I排除外源DNA的轉(zhuǎn)化，說明兩親本菌株發(fā)生了

6、融合和染色體基因重組。融合菌株擴(kuò)增出的670 bp和408 bp的目的片段經(jīng)測(cè)序后與親本菌株TXRA1和ZBO78的序列經(jīng)比對(duì)分析，同源性均為100％，說明經(jīng)雙重PCR擴(kuò)增出的條帶是我們的目的片段，亦證明試驗(yàn)所得到的融合菌株發(fā)生了了真正的融合。 本研究確定了11株能夠表達(dá)兩親本菌株基因組的陽性融合子，在國(guó)內(nèi)外尚屬首次，既發(fā)展了細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)，又為研制鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌融合雙聯(lián)弱毒菌苗奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研制細(xì)菌多聯(lián)