鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌融合菌株的構建及其雙重PCR檢測方法的建立.pdf

1、本研究從浙江省主要養(yǎng)鴨地區(qū)分離到13株鴨疫里默氏桿菌和19株大腸桿菌，藥敏試驗結果表明浙江省各地區(qū)鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌耐藥情況非常嚴重，其中鴨疫里默氏桿菌總體上對多粘菌素、卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、復方新諾明等藥物的耐藥性很嚴重；大腸桿菌的耐藥情況更為嚴重，大腸桿菌總體上對紅霉素、麥迪霉素、氟哌酸、氨芐青霉素、青霉素G、林可霉素、阿莫西林、鏈霉素等藥物的耐藥性很嚴重。鴨疫里默氏桿菌總體上可耐受6種抗生素，占抗生素種類的比例為31

2、.6％；大腸桿菌更是達到了總體上可耐受11種抗生素，占抗生素種類的比例為57.9％，如此嚴重的多重耐藥性必將給防治帶來很大的困難。 為發(fā)展細菌原生質體融合技術，探索研制細菌多聯(lián)菌苗的新方法、新途徑，本研究選用鴨疫里默氏桿菌和鴨大腸桿菌的優(yōu)勢血清型TXRA1和ZBO78進行融合試驗，并用氯霉素(Chl)、紅霉素(Ery)對其進行抗藥性誘導培育出耐藥標記菌株鴨疫里默氏桿菌TXRA1(chlr，Erys)和鴨大腸桿菌ZBO78(Ery

3、r，Chls)菌株。試驗目的是摸索該菌株的原生質體制備和再生的條件并進行優(yōu)化，培育雙價融合菌株為預防這兩種疾病提供新方法。 通過優(yōu)化Lysozyme-EDTA的工作時間和作用濃度，最后確定鴨疫里默氏桿菌TXRA1以Lysozyme0.1 g/L作用20 min后補加EDTA至終濃度為0.01mol/L繼續(xù)作用作用45 min為最佳試驗條件，并成功獲得了92％的原生質體制備率；鴨大腸桿菌ZBO78以Lysozyme0.2 g/L作

4、用20 min后補加EDTA至終濃度為0.01 mol/L繼續(xù)作用16 min為最佳試驗條件，并成功獲得了91.94％的原生質體制備率。通過進一步優(yōu)化原生質體的制備方式、高滲懸浮緩沖液以及高滲再生培養(yǎng)基中的蔗糖濃度、瓊脂濃度、pH值、離子濃度等因素，鴨疫里默氏桿菌TXRA1成功獲得了38.77％的原生質體再生率；鴨大腸桿菌ZBO78成功獲得了37.29％的原生質體再生率。 根據(jù)對鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌原生質體的制備和再生條件的

5、優(yōu)化后的最佳條件，我們應用PEG法成功地構建了鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌雙型融合菌株，獲得了31株具有雙親菌株耐藥性的雙型融合菌株。鑒于試驗所得到的31株融合子能夠發(fā)生自凝現(xiàn)象，本試驗建立了基于兩親本菌株部分外膜蛋白(ompA)為靶基因的雙重PCR檢測方法，經(jīng)雙重PCR擴增后其中有11株融合菌株能夠表達兩親本的ompA基因，有20株僅表達親本大腸桿菌的ompA基因，另外實驗過程中加入Dnase I排除外源DNA的轉化，說明兩親本菌株發(fā)生了

6、融合和染色體基因重組。融合菌株擴增出的670 bp和408 bp的目的片段經(jīng)測序后與親本菌株TXRA1和ZBO78的序列經(jīng)比對分析，同源性均為100％，說明經(jīng)雙重PCR擴增出的條帶是我們的目的片段，亦證明試驗所得到的融合菌株發(fā)生了了真正的融合。 本研究確定了11株能夠表達兩親本菌株基因組的陽性融合子，在國內(nèi)外尚屬首次，既發(fā)展了細菌原生質體融合技術，又為研制鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌融合雙聯(lián)弱毒菌苗奠定了基礎，也為進一步研制細菌多聯(lián)