經(jīng)BcL-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對缺血性心功能不全兔心功能及血管新生的影響.pdf

1、目的:本實驗旨在觀察經(jīng)抗凋亡基因(Bcl-2)修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對缺血性心功能不全家兔心肌細(xì)胞調(diào)亡、血管新生及心功能的影響，并探討其可能機(jī)制。
　　方法:BMSCs分離、培養(yǎng)及純化:采用骨髓穿刺法獲取含BMSCs的兔骨髓液，在體外經(jīng)密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)法，獲取足量、純化的BMSCs。重組腺病毒載體的構(gòu)建:用酶切法將目的基因(Bcl-2)從原始質(zhì)粒上切下，并與pShuttle()CMV-EGFP重組穿梭載體連

2、接，然后將pShuttle-CMV-EGFP-Bcl-2基因片段連接到 pA(。。)載體()上,獲得含Bcl-2的重組腺病毒載體質(zhì)粒。用重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，收集病毒并大量擴(kuò)增，經(jīng)反復(fù)凍融后置于-80℃保存待用。轉(zhuǎn)染細(xì)胞前，將重組腺病毒液解凍、復(fù)蘇并進(jìn)行滴度測定。細(xì)胞轉(zhuǎn)染:選取生長狀態(tài)良好的BMSCs，采用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的腺病毒及重組Bcl-2-腺病毒分別轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞。模型制備及細(xì)胞移植:將28只新西蘭兔隨機(jī)

3、分為以下3組:MI+BMSCs+Bcl-2組、MI+BMSCs組和MI+DMEM組，分別結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型。2周后經(jīng)心臟超聲篩查，將造模成功（心功能不全標(biāo)準(zhǔn)為:LVEF≤50％）的各組家兔于心肌梗死邊緣區(qū)分別注射等量的腺病毒-Bcl-2轉(zhuǎn)染的BMSCs（MI+BMSCs+Bcl-2組）、腺病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs（MI+BMSCs組）及DMEM液（MI+DMEM組）。指標(biāo)觀察:細(xì)胞移植后4周再次經(jīng)超聲測定心功能:左室射血分

4、數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率(LVFS)、左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）及左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）;切取正常及梗死邊緣區(qū)心肌組織，制作石蠟及冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的存活及分布;采用蘇木精-伊紅(H-E)染色法評估心肌病理學(xué)改變;原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測心肌凋亡細(xì)胞數(shù)并計算凋亡率;免疫組化染色檢測CD31的表達(dá)，計算新生毛細(xì)血管密度;RT-PCR檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因表達(dá)。并分別與心功能（LVEF

5、）進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1、BMSCs分離及培養(yǎng)情況:骨髓液經(jīng)Percoll分離液密度梯度離心后，可見乳白色絮狀物層，經(jīng)反復(fù)換液及貼壁培養(yǎng)后獲得純化的BMSCs，24-48h后觀察到散在貼壁的紡錘狀BMSCs，7-10d時BMSCs呈長梭狀，細(xì)胞間形成突起，胞核居中，細(xì)胞排列疏松，18-21d可見形態(tài)規(guī)則的單層融合束狀貼壁細(xì)胞，排列緊密呈漩渦狀、放射狀。經(jīng)胰蛋白酶消化融合的BMSCs，以1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2

6、4h后細(xì)胞完全貼壁，3-5d后即達(dá)80％融合。傳至第10代時細(xì)胞生長速度逐漸減慢;
　　2、本實驗成功構(gòu)建出大量重組腺病毒載體，凍存的病毒液經(jīng)連續(xù)梯度稀釋后分別感染293細(xì)胞，經(jīng)觀察細(xì)胞病變率，計算病毒最終滴度(T)為2.5×1010PFU/ml;
　　3、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài):選用生長狀態(tài)良好的第九代BMSCs()經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染24-48h后，于熒光顯微鏡下觀察到帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記(EGFP)的BMSCs，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)均一呈

7、長梭狀，經(jīng)預(yù)實驗測定MOI值為500時轉(zhuǎn)染效率最佳。
　　4、模型建立及動物存活情況:28只新西蘭兔接受造模手術(shù)，術(shù)后共有24只存活，經(jīng)超聲學(xué)驗證其LVEF均≤50％。其中MI+BMSCs+Bcl-2組存活8只，死亡1只;MI+BMSCs組存活8只，死亡2只;MI+DMEM組存活8只，死亡1只。共死亡4只，2只于結(jié)扎前降支過程中誘發(fā)室顫死亡，1只造模后呼吸驟停死亡，1只于二次開胸細(xì)胞移植后48h死亡。
　　5、熒光顯微鏡下觀

8、察細(xì)胞存活情況:BMSCs移植后4周，MI+BMSCs+Bcl-2組及MI+BMSCs組在熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光，MI+DMEM組無綠色熒光。
　　6、普通光鏡下觀察心肌病理學(xué)變化:正常心肌細(xì)胞形態(tài)均一、排列整齊。細(xì)胞質(zhì)染色均勻，呈淡藍(lán)色，胞核大小一致，呈橢圓形或圓形，居胞質(zhì)中央。梗死邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維部分?jǐn)嗔?，?xì)胞間可見多種炎性細(xì)胞浸潤。梗死區(qū)正常心肌細(xì)胞形態(tài)消失，代之以成纖維細(xì)胞及粗大的膠原纖維束，排列

9、較疏松，其間未見炎性細(xì)胞浸潤。各組梗死邊緣區(qū)心肌組織與正常心肌組織比較可發(fā)現(xiàn):MI+BMSCs+Bcl-2組病理學(xué)改變較輕微，MI+BMSCs組其次，MI+DMEM組較嚴(yán)重。
　　7、心肌梗死邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡率、新生血管密度及VEGF mRNA表達(dá)量:MI+BMSCs+Bcl-2組及MI+BMSCs組凋亡率均較MI+DMEM組降低，其中前者降低更為顯著[(30.75±5.65)％，(44.14±5.99)％，(63.38±8.52)

10、％，F(xiàn)=46.00，P＜0.05]; MI+BMSCs+Bcl-2組毛細(xì)血管密度及VEGF基因表達(dá)量（RQ值）均明顯高于MI+BMSCs組，后組又明顯高于MI+DMEM組（毛細(xì)血管密度:24.25±3.46，14.38±2.92，6.88±2.03，F(xiàn)=74.07，P＜0.05:RQ:1.64±0.29,0.99±0.17,0.64±0.19, F=40.56, P＜0.05)。
　　8、細(xì)胞移植4周后經(jīng)超聲檢測各組心功能:與MI

11、+DMEM組相比，MI+BMSCs+Bcl-2組和MI+BMSCs組的LVEF及LVFS均明顯升高，LVEDD及LVESD均明顯降低，其中MI+BMSCs+Bcl-2組變化更為顯著;[LVEF:(66.63±2.67)％,(60.50±3.16)％,(55.25±2.60)％, F=32.532,P＜0.05; LVFS:(40.50±1.60)％,(34.63±2.33)％,(27.25±2.05)％,F=86.736, P＜0.05

12、; LVEDD:(10.13±0.64)mm,(12.07±0.59)mm,(13.93+0.51)mm,F=85.225,P＜0.05; LVESD:(6.61+0.35)mm,(7.02+0.26)mm,(8.20±0.49)mm, F=37.697,P＜0.05]。
　　9、相關(guān)性分析結(jié)果:LVEF與心肌細(xì)胞的凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.769，P＜0.01，Y=76.091-0.36X);與毛細(xì)血管密度及VEGF mRNA的