肝臟富含的轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(LAP1)對肝癌干細胞負向調(diào)控作用的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是一種全球常見的、高發(fā)的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，其中肝癌所致的死亡率在中國高居第二位。根據(jù)其組織學分型，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的類型，占總數(shù)的85％-90％。對于肝癌的治療，近階段首選的方法依然是手術(shù)切除。盡管近年來在肝癌的診斷以及外科治療、生物治療等綜合治療手段方面取得了很大的進步，但患者的5年生存率仍然沒有得到較大的改善，由于易復發(fā)和肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，進行放療或化療效果也不甚理想，

2、因此肝癌患者的預后不容樂觀。究其原因，主要是因為腫瘤細胞尤其是腫瘤干細胞的存在，在肝癌復發(fā)和異質(zhì)性維持中具有重要的作用。
　　腫瘤干細胞理論的提出是基于腫瘤組織中并非所有的細胞都能夠無限增殖，而只有存在于其中的數(shù)量極少的細胞才能持續(xù)地進行自我更新，并能形成處于各種分化階段的具有異質(zhì)性的腫瘤細胞。BonnetD等首次報道在急性髓細胞性白血病中有腫瘤干細胞的存在，到目前為止，人們已經(jīng)分離并鑒定出包括黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌

3、、肺癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌等至少30多種腫瘤的干細胞。根據(jù)文獻報道，肝癌中也鑒定出了肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)，鑒定的表面標志物有CD133、CD13、CD90、EpCAM、OV6或CD24等。有文獻證實，肝癌干細胞是肝癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)與耐藥的根源。因此尋找新的、有效的靶向肝癌干細胞的治療靶點，對于開發(fā)針對肝癌干細胞的藥物或治療策略，最終能有效地治療腫瘤的轉(zhuǎn)移、復發(fā)和耐藥以降低高死亡率，具有非常重要

4、的科學意義和臨床應用潛力。
　　轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ是CEBPs(CCAAT enhancer binding proteins)家族中已發(fā)現(xiàn)的6種成員之一，其C端具有高度保守的bZIP結(jié)構(gòu)域:包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化功能域（亮氨酸拉鏈），bZIP結(jié)構(gòu)域可以和靶基因的啟動子、增強子區(qū)域的調(diào)節(jié)序列相互作用，從而對靶基因進行表達調(diào)控。
　　C/EBPβ基因mRNA存在3個轉(zhuǎn)錄起始位點，因此可以選擇性剪接形成3個異構(gòu)體，翻譯形

5、成3種蛋白質(zhì)，分別為LAP1(38kDa)和LAP2(35kDa)及LIP(20kDa)。其中LAP1和LAP2既有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，又有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，LIP只有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，兩者在功能上具有拮抗作用。其中LAP1是在肝臟中表達最高的亞型。
　　C/EBPβ是人與嚙齒動物間進化高度保守的蛋白，在機體各組織中廣泛表達。該基因參與細胞增殖、分化、凋亡及機體的免疫、應激反應、能量代謝、血液生成等生命活動。C/EBPβ還參與到了腫瘤

6、的發(fā)生與進展，近些年研究表明，C/EBPβ的表達失調(diào)可以導致多種腫瘤發(fā)生惡化，如膠質(zhì)瘤、Wilm's瘤、前列腺癌、腎細胞瘤、卵巢癌等。LAP1是具有廣泛功能的重要的轉(zhuǎn)錄因子，它參與增殖、凋亡、侵襲、EMT等細胞分子事件進而影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本課題利用生物信息學的方法，并結(jié)合臨床組織樣本，發(fā)現(xiàn)LAP1在肝癌中表達顯著降低，而LAP1在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及對肝癌干細胞(LCSCs)的影響卻尚不清楚。本課題結(jié)合體外、體內(nèi)實驗系統(tǒng)研究了

7、LAP1在肝癌及肝癌干細胞中的生物學作用，并針對LAP1相關信號轉(zhuǎn)導的特點，選擇小分子藥物MDV3100開展了初步的臨床轉(zhuǎn)化研究。
　　本課題首先通過生物信息學的方法及對肝癌組織臨床樣本的檢測，比較LAP1在肝癌組織與癌旁組織或正常肝組織中的表達，發(fā)現(xiàn)LAP1在肝癌組織中表達低;進而運用流式細胞術(shù)及懸浮成球試驗，比較LAP1在CD13+肝癌干細胞與非干細胞的表達情況，結(jié)果顯示腫瘤干細胞中LAP1的表達顯著低于非干細胞中表達，提示L

8、AP1可能對肝癌惡性生物學行為起到負向調(diào)控作用。
　　為了進一步探討LAP1的細胞生物學功能，本課題進一步在肝癌細胞中過表達LAP1后，利用體外和體內(nèi)實驗模型，系統(tǒng)地分析了其對肝癌干細胞進而對肝癌群體細胞的各種生物學行為的影響。首先，包裝慢病毒，用慢病毒介導的方法建立穩(wěn)定過表達LAP1及GFP對照質(zhì)粒的肝癌細胞系Huh7和CLC13，在體外進行懸浮成球?qū)嶒灧治鲞^表達LAP1對成球率的影響，并利用流式細胞術(shù)和qPCR分析過表達LAP

9、1對干性標志表達的影響，結(jié)果提示過表達LAP1可以抑制肝癌細胞的成球能力、下調(diào)肝癌干細胞的比例、以及肝癌干細胞標志物的表達水平;同時，開展了CCK8增殖實驗、平板克隆形成實驗、劃痕實驗、Transwell遷移及侵襲實驗分析過表達LAP1對肝癌細胞的影響，并分析過表達LAP1對細胞周期、細胞凋亡的影響，結(jié)果提示LAP1過表達能顯著抑制肝癌細胞的增殖能力、遷移能力與侵襲能力，并且誘發(fā)細胞周期阻滯;最后進行裸鼠成瘤實驗，觀察并分析過表達LAP

10、1對肝癌細胞小鼠體內(nèi)成瘤性和腫瘤生長的影響，結(jié)果提示LAP1過表達降低了肝癌細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力:皮下成瘤的數(shù)目、體積和重量均較對照組低，同時LAP1過表達降低瘤體干性標志物CD13、CD133及EpCAM的表達，同時顯著降低增殖標志物Ki67的表達。
　　細胞功能研究表明，LAP1表現(xiàn)出顯著的腫瘤生物學功能的抑制作用，并參與肝癌干細胞的干性調(diào)控。諸多結(jié)果均提示LAP1可以作為肝癌治療的有效靶標，基因治療存在著很大的風險，臨床

11、應用還有很多挑戰(zhàn)，因此篩選出可上調(diào)LAP1的小分子藥物，具有更大的臨床轉(zhuǎn)化應用的潛力。有研究表明，雄激素受體對LAP1具有負向調(diào)控作用，而雄激素受體的表達與肝癌的預后具有相關性，這就提示通過抑制雄激素受體上調(diào)LAP1的表達在肝癌治療中具有潛在應用價值。雄激素受體拮抗劑MDV3100是雄激素受體高度選擇性拮抗劑，在前列腺癌的內(nèi)分泌治療中應用廣泛。
　　本課題進一步開展了雄激素受體拮抗劑MDV3100對肝癌治療的初步研究，促進LAP1

12、成為肝癌治療靶標的轉(zhuǎn)化應用。在肝癌細胞中，加入不同濃度的MDV3100，檢測其對細胞活力的影響，結(jié)果顯示MDV3100可降低肝癌細胞的活性;然后對不同MDV3100作用濃度處理后的肝癌細胞進行qPCR及WB檢測，發(fā)現(xiàn)MDV3100可使LAP1的表達升高同時衰老標志物P53、P21、P16的表達也升高;結(jié)合經(jīng)MDV3100處理后細胞形態(tài)上的體積增大及對衰老相關的β-半乳糖苷酶表達的比較而發(fā)現(xiàn)的SA-β-Gal染色陽性的明顯增強，可初步判斷

13、出MDV3100可使肝癌細胞發(fā)生衰老;另外，對不同MDV3100作用濃度處理后的細胞進行細胞周期檢測，發(fā)現(xiàn)MDV3100可抑制肝癌細胞的細胞周期。綜上，MDV3100可通過上調(diào)LAP1誘導肝癌細胞發(fā)生衰老進而抑制腫瘤，因而LAP1可能可以作為肝癌治療的新靶點，希望通過本課題的實施為肝癌的診療提供新的思路和可行方法。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)C/EBPβ在肝癌及肝癌干細胞中低表達;C/EBPβ的最主要且在肝臟中表達量最高的亞