肝臟富含的轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(LAP1)對(duì)肝癌干細(xì)胞負(fù)向調(diào)控作用的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是一種全球常見的、高發(fā)的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，其中肝癌所致的死亡率在中國(guó)高居第二位。根據(jù)其組織學(xué)分型，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的類型，占總數(shù)的85％-90％。對(duì)于肝癌的治療，近階段首選的方法依然是手術(shù)切除。盡管近年來(lái)在肝癌的診斷以及外科治療、生物治療等綜合治療手段方面取得了很大的進(jìn)步，但患者的5年生存率仍然沒有得到較大的改善，由于易復(fù)發(fā)和肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，進(jìn)行放療或化療效果也不甚理想，

2、因此肝癌患者的預(yù)后不容樂(lè)觀。究其原因，主要是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞尤其是腫瘤干細(xì)胞的存在，在肝癌復(fù)發(fā)和異質(zhì)性維持中具有重要的作用。
　　腫瘤干細(xì)胞理論的提出是基于腫瘤組織中并非所有的細(xì)胞都能夠無(wú)限增殖，而只有存在于其中的數(shù)量極少的細(xì)胞才能持續(xù)地進(jìn)行自我更新，并能形成處于各種分化階段的具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞。BonnetD等首次報(bào)道在急性髓細(xì)胞性白血病中有腫瘤干細(xì)胞的存在，到目前為止，人們已經(jīng)分離并鑒定出包括黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌

3、、肺癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌等至少30多種腫瘤的干細(xì)胞。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肝癌中也鑒定出了肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells，LCSCs)，鑒定的表面標(biāo)志物有CD133、CD13、CD90、EpCAM、OV6或CD24等。有文獻(xiàn)證實(shí)，肝癌干細(xì)胞是肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與耐藥的根源。因此尋找新的、有效的靶向肝癌干細(xì)胞的治療靶點(diǎn)，對(duì)于開發(fā)針對(duì)肝癌干細(xì)胞的藥物或治療策略，最終能有效地治療腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥以降低高死亡率，具有非常重要

4、的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用潛力。
　　轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ是CEBPs(CCAAT enhancer binding proteins)家族中已發(fā)現(xiàn)的6種成員之一，其C端具有高度保守的bZIP結(jié)構(gòu)域:包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化功能域（亮氨酸拉鏈），bZIP結(jié)構(gòu)域可以和靶基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子區(qū)域的調(diào)節(jié)序列相互作用，從而對(duì)靶基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。
　　C/EBPβ基因mRNA存在3個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，因此可以選擇性剪接形成3個(gè)異構(gòu)體，翻譯形

5、成3種蛋白質(zhì)，分別為L(zhǎng)AP1(38kDa)和LAP2(35kDa)及LIP(20kDa)。其中LAP1和LAP2既有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，又有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，LIP只有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，兩者在功能上具有拮抗作用。其中LAP1是在肝臟中表達(dá)最高的亞型。
　　C/EBPβ是人與嚙齒動(dòng)物間進(jìn)化高度保守的蛋白，在機(jī)體各組織中廣泛表達(dá)。該基因參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及機(jī)體的免疫、應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、血液生成等生命活動(dòng)。C/EBPβ還參與到了腫瘤

6、的發(fā)生與進(jìn)展，近些年研究表明，C/EBPβ的表達(dá)失調(diào)可以導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生惡化，如膠質(zhì)瘤、Wilm's瘤、前列腺癌、腎細(xì)胞瘤、卵巢癌等。LAP1是具有廣泛功能的重要的轉(zhuǎn)錄因子，它參與增殖、凋亡、侵襲、EMT等細(xì)胞分子事件進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本課題利用生物信息學(xué)的方法，并結(jié)合臨床組織樣本，發(fā)現(xiàn)LAP1在肝癌中表達(dá)顯著降低，而LAP1在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及對(duì)肝癌干細(xì)胞(LCSCs)的影響卻尚不清楚。本課題結(jié)合體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了

7、LAP1在肝癌及肝癌干細(xì)胞中的生物學(xué)作用，并針對(duì)LAP1相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn)，選擇小分子藥物MDV3100開展了初步的臨床轉(zhuǎn)化研究。
　　本課題首先通過(guò)生物信息學(xué)的方法及對(duì)肝癌組織臨床樣本的檢測(cè)，比較LAP1在肝癌組織與癌旁組織或正常肝組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LAP1在肝癌組織中表達(dá)低;進(jìn)而運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)及懸浮成球試驗(yàn)，比較LAP1在CD13+肝癌干細(xì)胞與非干細(xì)胞的表達(dá)情況，結(jié)果顯示腫瘤干細(xì)胞中LAP1的表達(dá)顯著低于非干細(xì)胞中表達(dá)，提示L

8、AP1可能對(duì)肝癌惡性生物學(xué)行為起到負(fù)向調(diào)控作用。
　　為了進(jìn)一步探討LAP1的細(xì)胞生物學(xué)功能，本課題進(jìn)一步在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LAP1后，利用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，系統(tǒng)地分析了其對(duì)肝癌干細(xì)胞進(jìn)而對(duì)肝癌群體細(xì)胞的各種生物學(xué)行為的影響。首先，包裝慢病毒，用慢病毒介導(dǎo)的方法建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LAP1及GFP對(duì)照質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系Huh7和CLC13，在體外進(jìn)行懸浮成球?qū)嶒?yàn)分析過(guò)表達(dá)LAP1對(duì)成球率的影響，并利用流式細(xì)胞術(shù)和qPCR分析過(guò)表達(dá)LAP

9、1對(duì)干性標(biāo)志表達(dá)的影響，結(jié)果提示過(guò)表達(dá)LAP1可以抑制肝癌細(xì)胞的成球能力、下調(diào)肝癌干細(xì)胞的比例、以及肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平;同時(shí)，開展了CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)分析過(guò)表達(dá)LAP1對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，并分析過(guò)表達(dá)LAP1對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果提示LAP1過(guò)表達(dá)能顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力、遷移能力與侵襲能力，并且誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯;最后進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察并分析過(guò)表達(dá)LAP

10、1對(duì)肝癌細(xì)胞小鼠體內(nèi)成瘤性和腫瘤生長(zhǎng)的影響，結(jié)果提示LAP1過(guò)表達(dá)降低了肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力:皮下成瘤的數(shù)目、體積和重量均較對(duì)照組低，同時(shí)LAP1過(guò)表達(dá)降低瘤體干性標(biāo)志物CD13、CD133及EpCAM的表達(dá)，同時(shí)顯著降低增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)。
　　細(xì)胞功能研究表明，LAP1表現(xiàn)出顯著的腫瘤生物學(xué)功能的抑制作用，并參與肝癌干細(xì)胞的干性調(diào)控。諸多結(jié)果均提示LAP1可以作為肝癌治療的有效靶標(biāo)，基因治療存在著很大的風(fēng)險(xiǎn)，臨床

11、應(yīng)用還有很多挑戰(zhàn)，因此篩選出可上調(diào)LAP1的小分子藥物，具有更大的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的潛力。有研究表明，雄激素受體對(duì)LAP1具有負(fù)向調(diào)控作用，而雄激素受體的表達(dá)與肝癌的預(yù)后具有相關(guān)性，這就提示通過(guò)抑制雄激素受體上調(diào)LAP1的表達(dá)在肝癌治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。雄激素受體拮抗劑MDV3100是雄激素受體高度選擇性拮抗劑，在前列腺癌的內(nèi)分泌治療中應(yīng)用廣泛。
　　本課題進(jìn)一步開展了雄激素受體拮抗劑MDV3100對(duì)肝癌治療的初步研究，促進(jìn)LAP1

12、成為肝癌治療靶標(biāo)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。在肝癌細(xì)胞中，加入不同濃度的MDV3100，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示MDV3100可降低肝癌細(xì)胞的活性;然后對(duì)不同MDV3100作用濃度處理后的肝癌細(xì)胞進(jìn)行qPCR及WB檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MDV3100可使LAP1的表達(dá)升高同時(shí)衰老標(biāo)志物P53、P21、P16的表達(dá)也升高;結(jié)合經(jīng)MDV3100處理后細(xì)胞形態(tài)上的體積增大及對(duì)衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶表達(dá)的比較而發(fā)現(xiàn)的SA-β-Gal染色陽(yáng)性的明顯增強(qiáng)，可初步判斷

13、出MDV3100可使肝癌細(xì)胞發(fā)生衰老;另外，對(duì)不同MDV3100作用濃度處理后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MDV3100可抑制肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期。綜上，MDV3100可通過(guò)上調(diào)LAP1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生衰老進(jìn)而抑制腫瘤，因而LAP1可能可以作為肝癌治療的新靶點(diǎn)，希望通過(guò)本課題的實(shí)施為肝癌的診療提供新的思路和可行方法。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)C/EBPβ在肝癌及肝癌干細(xì)胞中低表達(dá);C/EBPβ的最主要且在肝臟中表達(dá)量最高的亞