鋅鐵調(diào)控蛋白1對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用的研究.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)以兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rabbit bone marrow mesenchy-mal stem cells rabBMSCs)為研究對(duì)象。通過鋅鐵調(diào)控蛋白1(ZIP1)體外作用于rabBMSCs,研究ZIP1蛋白體外誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的可能機(jī)制,為臨床治療酒精性股骨頭壞死提供相關(guān)體外研究支持。
　　方法:
　?、俳abBMSCs培養(yǎng)體系，采用不同濃度的酒精(0.00 mol/L、

2、0.03 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L)處理rabBMSCs6小時(shí)，使用Western-Blotting法檢測細(xì)胞中ALP、OCN、I型膠原以及Runx2蛋白表達(dá)情況。
　?、跇?gòu)建ZIP1蛋白過表達(dá)載體。以全基因合成法合成ZIP1基因的全長序列后采用雙酶切法進(jìn)行酶切，目的片段經(jīng)雙酶切后連接入pcDNA3.1(+)載體中，載體構(gòu)建完成后使用PCR產(chǎn)物電泳及基因測序鑒定，鑒定合格則可用作

3、下一步實(shí)驗(yàn)。
　　③篩選ZIP1小干擾RNA(siRNA)。以兔的ZIP1基因?yàn)榘袠?biāo)，經(jīng)篩選后由生物公司直接合成3對(duì)有效ZIP1 siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3），將3對(duì)siRNA分別以25nM濃度轉(zhuǎn)染入rabBMSCs中，同時(shí)設(shè)正常組即空白對(duì)照組培養(yǎng)，36小時(shí)后使用R-T PCR對(duì)ZIP1mRNA的表達(dá)進(jìn)行定性分析，篩選出抑制率最高效的ZIP1 siRNA序列，構(gòu)建ZIP1 siRNA載體用于后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)

4、。
　?、躗IP1參與rabBMSCs成骨分化。將實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組，A組為正常細(xì)胞培養(yǎng)組，B組為ZIP1過表達(dá)組，C組為ZIP1 siRNA組；細(xì)胞培養(yǎng)至48h后采用Western-Blotting檢測成骨分化相關(guān)蛋白ALP、OCN、I型膠原表達(dá)情況。
　?、菅芯縕IP1蛋白對(duì)rabBMSCs凋亡的影響。將實(shí)驗(yàn)分為4組，第1組為正常細(xì)胞培養(yǎng)組，第2組為缺氧缺糖細(xì)胞培養(yǎng)組，第3組為ZIP1過表達(dá)缺氧缺糖培養(yǎng)組，第4組為ZIP1

5、siRNA缺氧缺糖培養(yǎng)組。細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后采用Tunel法及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，WB檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax及Caspase6表達(dá)。
　　結(jié)果:
　?、賅estern-Blotting檢測細(xì)胞中ALP蛋白相對(duì)含量分別為:0.66±0.03、0.58±0.06、0.51±0.02、0.4±0.02、0.38±0.01；I型膠原蛋白相對(duì)含量分別為:0.69±0.03、0.54±0.03、0.59±0.05、0.41±0.02

6、、0.23±0.01；OCN蛋白相對(duì)含量分別為:1.08±0.03、1.0±0.05、0.93±0.02、0.68±0.03、0.63±0.01；RUNX2蛋白相對(duì)含量分別為:1.08±0.03、0.65±0.01、0.52±0.02、0.41±0.03、0.35±0.02。
　?、赯IP1過表達(dá)載體構(gòu)建后以通用引物進(jìn)行測序鑒定，測序峰圖正常，無雜峰或疊帶，序列對(duì)比吻合；
　?、坩娪肦eal-time PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Z

7、IP1 mRNA的結(jié)果相對(duì)含量分別為:1.00±0.32、0.41±0.18、1.96±0.08、0.11±0.07。
　　④經(jīng)Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)，ALP蛋白相對(duì)含量分別為:1.32±0.04、2.67±0.19、0.8133±0.10； I型膠原蛋白相對(duì)含量分別為:1.72±0.09、2.68±0.17、1.54±0.17；OCN蛋白相對(duì)含量分別為:1.45±0.15、2.08±0.11、0.87±

8、0.06。
　　⑤ Tunel法檢測4組細(xì)胞凋亡率分別為(0.66±0.18)％、(13.19±1.8)%、(1.76±0.57)%、(24.43±6)%;⑥流式細(xì)胞儀檢測4組細(xì)胞凋亡率分別為(0.56±0.02)%、(1.29±0.05)%、(0.77±0.04)%、(2.53±0.02)%。
　　⑦Western-Blotting檢測4組細(xì)胞中Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.36±0.02、0.68±0.04、0.68±0

9、.04、1.14±0.3;Caspase6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.30±0.05、0.63±0.02、0.38±0.02、0.95±0.03。
　　結(jié)論:
　　酒精可以抑制rabBMSCs中ALP、OCN、RNUX2、I型膠原蛋白表達(dá)，且隨著濃度的增加，抑制效果更顯著。ALP、OCN、I型膠原、Runx2蛋白可作為rabBMSCs向成骨分化鑒定指標(biāo)之一。ZIP1蛋白可以顯著增加rabBMSCs成骨分化指標(biāo)ALP、OCN、I型