Purα與Egr-1對(duì)淀粉樣前體蛋白(APP)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述：
　　第一部分 了解Purα缺失片段對(duì)APP啟動(dòng)子下調(diào)的作用效果來確定Purα蛋白的活性功能域以及其與Egr-1之間的相互作用
　　目的：淀粉樣前體蛋白(APP)是一種跨膜蛋白，它的異常代謝產(chǎn)物A-β在神經(jīng)組織中的積累所形成的senile plaque是Alzheimer病的主要發(fā)病因素之一。前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，Purα蛋白能下調(diào)APP基因的表達(dá)，而Egr-1蛋白則能上調(diào)APP基因的表達(dá)。

2、然而Purα蛋白的五個(gè)功能區(qū)域在此調(diào)節(jié)過程中是如何發(fā)揮作用的，它的活性功能域究竟位于什么地方，目前仍然不是十分清楚。通過研究了解Purα缺失片段對(duì)APP啟動(dòng)子下調(diào)的作用效果來確定Purα蛋白的活性功能域以及其與Egr-1之間的相互作用，正是我們所研究的主旨所在。
　　方法：（1）根據(jù)Purα和Egr-1基因序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建pCDNA3-Purα缺失突變體、pCDNA3-Egr-1質(zhì)粒、pGEX4T1-Purα缺失突變體和pGEX

3、4T1-Egr-1質(zhì)粒。（2）Luciferase assay，將Purα缺失突變體和APP啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染到U87細(xì)胞，通過對(duì)APP活性的分析，確定Purα對(duì)APP調(diào)控作用的功能區(qū)域。（3）Pull-down assay和Co-IP，確定Purα蛋白和Egr-1蛋白之間是有否直接的相互作用（physical interaction）。
　　結(jié)果：（1）重組質(zhì)粒pCDNA3-Purα缺失突變體和pCDNA3-Egr-1質(zhì)粒以及pGEX

4、4 T1-Purα缺失突變體和pGEX4 T1-Egr-1質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序后，證實(shí)克隆序列完全正確。（2）Luciferase assay證實(shí)Purα全長對(duì)APP基因表達(dá)下調(diào)作用最大，其他四個(gè)突變體對(duì)APP基因表達(dá)下調(diào)作用各不相同。（3）通過Pull-down assay和Co-IP實(shí)驗(yàn)，沒有發(fā)現(xiàn)Purα蛋白和Egr-1蛋白之間有直接的相互作用（Physical interaction）。
　　結(jié)論：（1）Purα蛋白對(duì)AP

5、P基因表達(dá)的調(diào)控依賴于其結(jié)構(gòu)的完整性，Purα結(jié)構(gòu)越完整，對(duì)APP啟動(dòng)子下調(diào)作用的效果越明顯,說明五個(gè)不同的蛋白結(jié)構(gòu)域共同作用才能發(fā)揮對(duì)APP基因的最大的調(diào)控作用。（2）Purα蛋白和Egr-1蛋白沒有直接的相互作用（Physical interaction），由于兩種蛋白在APP基因啟動(dòng)子上的結(jié)合部位是重合的，兩者有可能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其在APP啟動(dòng)子的5’ UTR區(qū)中的結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮調(diào)控作用，這也肯定了我們以前所提出的兩種蛋白之間存在

6、有一種互相置換作用的假說（Displacement hypothesis）。
　　第二部分 構(gòu)建Purα基因過表達(dá)以及SiRNA慢病毒表達(dá)載體，通過包裝病毒，以用于神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞感染及原代培養(yǎng)的神經(jīng)元的基因操作
　　目的：構(gòu)建Purα基因過表達(dá)以及SiRNA慢病毒表達(dá)載體，通過包裝病毒，以用于神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞感染及原代培養(yǎng)的神經(jīng)元的基因操作。
　　方法：1.過表達(dá)載體的構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)使用pCDH-EF1-MCS-T2A-cop

7、GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒載體，首先根據(jù)pCDH載體所含的多克隆位點(diǎn)的特點(diǎn)來選擇所要插入的內(nèi)切酶位點(diǎn)，合成含有該酶切位點(diǎn)的用于擴(kuò)增 Purα基因的上，下游引物，擴(kuò)增Purα全長基因，將PCR片段進(jìn)行純化和酶切，然后亞克隆到pCDH載體相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)之中，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定；2.ShRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：利用計(jì)算機(jī)輔助，選取有可能作為PurαSiRNA的序列，根據(jù)shRNA的特征，設(shè)計(jì)shRNA的

8、DNA序列以及其反向互補(bǔ)序列，然后合成該寡核苷酸，將該寡核苷酸退火，形成雙鏈DNA片段，然后再克隆到慢病毒載體pLKO.1 Puro的相應(yīng)位點(diǎn)中，通過測(cè)序鑒定陽性克隆。3.慢病毒包裝和滴度測(cè)定：將克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1 puro-shRNA載體和病毒包裝質(zhì)粒pCMV-VSV-G,pCMV-dR8.2 dvpr按相應(yīng)的比例轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，48小時(shí)后收集上清液，純化，濃縮，進(jìn)行滴度測(cè)定。
　　結(jié)果：測(cè)序結(jié)果證