RNA結合蛋白NOVA1調(diào)控間充質干細胞成脂分化的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，因其組織來源廣泛、免疫原性低并具免疫調(diào)節(jié)作用而成為臨床上最具應用前景的一類干細胞。RNA結合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）能夠在轉錄后水平調(diào)控基因表達，進而影響細胞增殖、分化、遷移與凋亡等一系列生物學特性。NOVA1(neuro-oncological vent

2、ral antigen1)最初被認為是神經(jīng)特異性的RBP，對神經(jīng)細胞的存活以及發(fā)育至關重要，參與神經(jīng)突觸蛋白基因的選擇性剪接;隨后，NOVA1在腫瘤細胞和棕色脂肪發(fā)育中的作用也相繼被發(fā)現(xiàn)。我們的前期研究顯示，在人MSCs成脂分化過程中NOVA1表達升高，而NOVA1在MSCs成脂分化中的作用及其調(diào)控機制有待深入研究。研究MSCs成脂分化機制對于了解脂肪組織的發(fā)育、治療脂肪細胞分化失衡的疾病具有重要的理論與臨床意義。
　　研究目的:

3、
　　1.明確脂肪間充質干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)與骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)正常培養(yǎng)及成脂分化過程中NOVA1的動態(tài)表達變化，并通過敲減和過表達實驗明確NOVA1對MSCs凋亡、遷移以及成脂分化的影響。
　　2.探討NOVA1調(diào)節(jié)MSCs成脂分化的分子機制。
　　3.探討影

4、響NOVA1基因表達的相關因素。
　　研究方法和結果:
　　1.MSCs及其成脂分化過程中RBPs的表達變化
　　方法:采用油紅O染色與茜素紅染色以及流式細胞鑒定人脂肪組織中分離的ADSCs;通過Real-time PCR檢測成脂分化過程中12個RBPs的表達;采用Real-timePCR檢測人MSCs向成骨、成肌分化過程中NOVA1的表達;采用免疫熒光或免疫組化的方法對ADSCs成脂分化過程和人腹部皮下脂肪組織中NO

5、VA1蛋白表達進行檢測;采用Real-time PCR檢測大鼠各組織中Nova1的表達。
　　結果:分離得到人ADSCs高表達CD44、CD73、CD90、CD105等間充質干細胞表面標志物，不表達CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR。ADSCs成脂誘導過程中，hnRNPH1和PTBP1在誘導7天表達顯著升高;hnRNPH2、RBM38、NOVA1在誘導3天和7天表達均顯著升高，其中NOVA1升高程度最為明顯，而

6、FOXC2在誘導3天和7天表達降低。TIA1、TIAL1、hnRNPF、hnRNPA1、hnRNPM、FOX2在ADSCs成脂分化過程中未發(fā)生明顯變化。MSCs向成骨、成肌方向分化過程中未檢測到NOVA1的表達發(fā)生明顯變化;免疫熒光顯示，未誘導的ADSCs中NOVA1主要在細胞質中表達，有明顯的核質表達區(qū)別，而在成脂誘導中，細胞質和細胞核中表達均升高，核質表達差別不明顯;人腹部皮下脂肪組織中NOVA1主要在成熟脂肪細胞的細胞核中表達;基

7、質血管成份中NOVA1的表達遠低于成熟脂肪組織;比較大鼠心臟、骨骼肌、脂肪、肝、肺、腎等組織，發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中Nova1表達最高，骨骼肌中次之，腎中表達最低。
　　2.NOVA1對MSCs凋亡和遷移以及成脂分化的影響
　　方法:NOVA1敲減后采用流式細胞術檢測ADSCs凋亡情況并利用劃線法檢測其遷移能力。為了研究NOVA1對MSCs分化能力的影響，通過在MSCs中敲減和過表達NOVA1并進行成脂誘導，在不同時間點采用Rea

8、l-time PCR的方法檢測成脂標志基因的表達，誘導7天采用油紅O染色觀察脂滴形成情況。
　　結果:NOVA1敲減后ADSCs凋亡水平增加，遷移能力下降。敲減NOVA1抑制MSCs成脂分化，過表達NOVA1后MSCs成脂分化能力增加。過表達NOVA1后即使不添加成脂誘導液，7天后成脂分化標志物ADIPOQ的表達仍升高，但未見脂滴形成。
　　3.NOVA1在MSCs成脂分化中的作用機制
　　方法:兩組ADSCs分別感染

9、NOVA1敲減(shNOVA1)及對照(Scramble)慢病毒后，收取RNA并命名為shNOVA1和Scramble，另取兩組ADSCs感染NOVA1敲減及對照慢病毒后成脂誘導3天，收取RNA并命名為shNOVA1_A3和Scramble_A3，對四組樣本進行全轉錄本表達譜芯片檢測以及差異基因GO分析和通路富集(pathway)分析;采用Western blot的方法對敲減NOVA1后成脂分化過程中未折疊蛋白應答(unfolded p

10、rotein response，UPR)相關蛋白表達進行驗證;在成脂誘導液中添加250nM的內(nèi)質網(wǎng)應激激動劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)處理7天，與未添加TG組比較脂滴的形成以及成脂分化標志基因的表達，western blot檢測UPR相關蛋白的表達;STRING網(wǎng)站對能夠與NOVA1相互作用的蛋白進行預測，通過IP實驗對預測到的蛋白進行驗證，并通過在ADSCs中敲減該蛋白后成脂誘導，檢測成脂分化標志基因的表達與脂滴的形

11、成。
　　結果:通過對Scramble_A3vs Scramble的差異基因比較分析，發(fā)現(xiàn)參與脂質代謝和脂質生物合成相關基因表達差異最為明顯。對123個參與脂質代謝的基因進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在成脂誘導過程中明顯升高或降低的基因在敲減NOVA1后升高或降低的程度減弱。提示NOVA1參與ADSCs成脂誘導過程中脂質代謝基因的表達調(diào)控。進一步對shNOVA1_A3vs Scramble_A3的差異基因進行通路富集(pathway)分析，發(fā)

12、現(xiàn)參與Unfolded Protein Response的基因表達差異最明顯，其次是PPAR信號通路。Western blot顯示參與UPR信號通路的基因在敲減NOVA1后被激活;激活內(nèi)質網(wǎng)應激信號抑制ADSCs成脂分化。此外，通過NOVA1結合蛋白預測以及IP結果證實NOVA1能夠與PTBP1相互結合，并且ADSCs成脂誘導7天PTBP1表達升高，敲減PTBP1抑制ADSCs成脂分化。
　　4.影響MSCs成脂分化過程中NOVA

13、1基因表達的相關因素
　　方法:采用不同濃度的Pilocarpine和NPY處理ADSCs，在1天、3天時采用Real-time PCR的方法檢測NOVA1的表達變化;不同的成脂誘導成分10-6M DEX、0.5mM IBMX、10μM Insulin、200μM吲哚美辛、1μM羅格列酮、完全成脂誘導液以及添加10μM PPARγ的拮抗劑GW9662的吲哚美辛、羅格列酮、完全成脂誘導液處理ADSCs，在1天、3天、7天時采用Rea

14、l-time PCR的方法檢測NOVA1的表達變化。
　　結果:不同濃度的Pilocarpine和NPY以及DEX和insulin對ADSCs中NOVA1的表達未見影響，IBMX在處理1天時誘導NOVA1表達升高，3天和7天影響不明顯;吲哚美辛在誘導3天和7天時可顯著促進NOVA1表達升高;而這種促進作用會被GW9662所抑制。
　　研究結論:
　　1.ADSCs中表達多種RBPs，在其成脂分化過程中，hnRNPH1、

15、PTBP1、hnRNPH2、RBM38、FOXC2、NOVA1等RBPs表達發(fā)生變化，NOVA1變化差異最明顯，而NOVA1在ADSCs成骨以及成肌分化過程中表達無顯著變化，說明NOVA1在干細胞分化中的表達具譜系特異性;NOVA在脂肪組織中的表達較在其它組織中高。提示NOVA1在脂肪分化中發(fā)揮特異性作用。
　　2.NOVA1敲減促進ADSCs凋亡，抑制其遷移。敲減NOVA1抑制ADSCs和BMSCs成脂分化過程中成脂相關基因的表

16、達與脂滴的形成，過表達NOVA1則有促進作用，說明NOVA1參與調(diào)控MSCs成脂分化;但單純過表達NOVA1不能激活MSCs的成脂分化。
　　3.NOVA1通過作用于脂質代謝相關基因以及UPR信號影響MSCs成脂分化，并且NOVA1可能與PTBP1作為復合體發(fā)揮作用。
　　4.NOVA1基因啟動子區(qū)域存在PPARγ應答元件，PPARγ配體吲哚美辛和羅格列酮能夠促進NOVA1的表達，這種促進作用可被PPARγ拮抗劑GW9662