RNA結(jié)合蛋白NOVA1調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，因其組織來源廣泛、免疫原性低并具免疫調(diào)節(jié)作用而成為臨床上最具應(yīng)用前景的一類干細(xì)胞。RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化、遷移與凋亡等一系列生物學(xué)特性。NOVA1(neuro-oncological vent

2、ral antigen1)最初被認(rèn)為是神經(jīng)特異性的RBP，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的存活以及發(fā)育至關(guān)重要，參與神經(jīng)突觸蛋白基因的選擇性剪接;隨后，NOVA1在腫瘤細(xì)胞和棕色脂肪發(fā)育中的作用也相繼被發(fā)現(xiàn)。我們的前期研究顯示，在人MSCs成脂分化過程中NOVA1表達(dá)升高，而NOVA1在MSCs成脂分化中的作用及其調(diào)控機(jī)制有待深入研究。研究MSCs成脂分化機(jī)制對(duì)于了解脂肪組織的發(fā)育、治療脂肪細(xì)胞分化失衡的疾病具有重要的理論與臨床意義。
　　研究目的:

3、
　　1.明確脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)正常培養(yǎng)及成脂分化過程中NOVA1的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，并通過敲減和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)明確NOVA1對(duì)MSCs凋亡、遷移以及成脂分化的影響。
　　2.探討NOVA1調(diào)節(jié)MSCs成脂分化的分子機(jī)制。
　　3.探討影

4、響NOVA1基因表達(dá)的相關(guān)因素。
　　研究方法和結(jié)果:
　　1.MSCs及其成脂分化過程中RBPs的表達(dá)變化
　　方法:采用油紅O染色與茜素紅染色以及流式細(xì)胞鑒定人脂肪組織中分離的ADSCs;通過Real-time PCR檢測(cè)成脂分化過程中12個(gè)RBPs的表達(dá);采用Real-timePCR檢測(cè)人MSCs向成骨、成肌分化過程中NOVA1的表達(dá);采用免疫熒光或免疫組化的方法對(duì)ADSCs成脂分化過程和人腹部皮下脂肪組織中NO

5、VA1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);采用Real-time PCR檢測(cè)大鼠各組織中Nova1的表達(dá)。
　　結(jié)果:分離得到人ADSCs高表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，不表達(dá)CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR。ADSCs成脂誘導(dǎo)過程中，hnRNPH1和PTBP1在誘導(dǎo)7天表達(dá)顯著升高;hnRNPH2、RBM38、NOVA1在誘導(dǎo)3天和7天表達(dá)均顯著升高，其中NOVA1升高程度最為明顯，而

6、FOXC2在誘導(dǎo)3天和7天表達(dá)降低。TIA1、TIAL1、hnRNPF、hnRNPA1、hnRNPM、FOX2在ADSCs成脂分化過程中未發(fā)生明顯變化。MSCs向成骨、成肌方向分化過程中未檢測(cè)到NOVA1的表達(dá)發(fā)生明顯變化;免疫熒光顯示，未誘導(dǎo)的ADSCs中NOVA1主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，有明顯的核質(zhì)表達(dá)區(qū)別，而在成脂誘導(dǎo)中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)均升高，核質(zhì)表達(dá)差別不明顯;人腹部皮下脂肪組織中NOVA1主要在成熟脂肪細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá);基

7、質(zhì)血管成份中NOVA1的表達(dá)遠(yuǎn)低于成熟脂肪組織;比較大鼠心臟、骨骼肌、脂肪、肝、肺、腎等組織，發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中Nova1表達(dá)最高，骨骼肌中次之，腎中表達(dá)最低。
　　2.NOVA1對(duì)MSCs凋亡和遷移以及成脂分化的影響
　　方法:NOVA1敲減后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs凋亡情況并利用劃線法檢測(cè)其遷移能力。為了研究NOVA1對(duì)MSCs分化能力的影響，通過在MSCs中敲減和過表達(dá)NOVA1并進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，在不同時(shí)間點(diǎn)采用Rea

8、l-time PCR的方法檢測(cè)成脂標(biāo)志基因的表達(dá)，誘導(dǎo)7天采用油紅O染色觀察脂滴形成情況。
　　結(jié)果:NOVA1敲減后ADSCs凋亡水平增加，遷移能力下降。敲減NOVA1抑制MSCs成脂分化，過表達(dá)NOVA1后MSCs成脂分化能力增加。過表達(dá)NOVA1后即使不添加成脂誘導(dǎo)液，7天后成脂分化標(biāo)志物ADIPOQ的表達(dá)仍升高，但未見脂滴形成。
　　3.NOVA1在MSCs成脂分化中的作用機(jī)制
　　方法:兩組ADSCs分別感染

9、NOVA1敲減(shNOVA1)及對(duì)照(Scramble)慢病毒后，收取RNA并命名為shNOVA1和Scramble，另取兩組ADSCs感染NOVA1敲減及對(duì)照慢病毒后成脂誘導(dǎo)3天，收取RNA并命名為shNOVA1_A3和Scramble_A3，對(duì)四組樣本進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜芯片檢測(cè)以及差異基因GO分析和通路富集(pathway)分析;采用Western blot的方法對(duì)敲減NOVA1后成脂分化過程中未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded p

10、rotein response，UPR)相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證;在成脂誘導(dǎo)液中添加250nM的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)處理7天，與未添加TG組比較脂滴的形成以及成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá)，western blot檢測(cè)UPR相關(guān)蛋白的表達(dá);STRING網(wǎng)站對(duì)能夠與NOVA1相互作用的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過IP實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)到的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，并通過在ADSCs中敲減該蛋白后成脂誘導(dǎo)，檢測(cè)成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá)與脂滴的形

11、成。
　　結(jié)果:通過對(duì)Scramble_A3vs Scramble的差異基因比較分析，發(fā)現(xiàn)參與脂質(zhì)代謝和脂質(zhì)生物合成相關(guān)基因表達(dá)差異最為明顯。對(duì)123個(gè)參與脂質(zhì)代謝的基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在成脂誘導(dǎo)過程中明顯升高或降低的基因在敲減NOVA1后升高或降低的程度減弱。提示NOVA1參與ADSCs成脂誘導(dǎo)過程中脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)調(diào)控。進(jìn)一步對(duì)shNOVA1_A3vs Scramble_A3的差異基因進(jìn)行通路富集(pathway)分析，發(fā)

12、現(xiàn)參與Unfolded Protein Response的基因表達(dá)差異最明顯，其次是PPAR信號(hào)通路。Western blot顯示參與UPR信號(hào)通路的基因在敲減NOVA1后被激活;激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)抑制ADSCs成脂分化。此外，通過NOVA1結(jié)合蛋白預(yù)測(cè)以及IP結(jié)果證實(shí)NOVA1能夠與PTBP1相互結(jié)合，并且ADSCs成脂誘導(dǎo)7天PTBP1表達(dá)升高，敲減PTBP1抑制ADSCs成脂分化。
　　4.影響MSCs成脂分化過程中NOVA

13、1基因表達(dá)的相關(guān)因素
　　方法:采用不同濃度的Pilocarpine和NPY處理ADSCs，在1天、3天時(shí)采用Real-time PCR的方法檢測(cè)NOVA1的表達(dá)變化;不同的成脂誘導(dǎo)成分10-6M DEX、0.5mM IBMX、10μM Insulin、200μM吲哚美辛、1μM羅格列酮、完全成脂誘導(dǎo)液以及添加10μM PPARγ的拮抗劑GW9662的吲哚美辛、羅格列酮、完全成脂誘導(dǎo)液處理ADSCs，在1天、3天、7天時(shí)采用Rea

14、l-time PCR的方法檢測(cè)NOVA1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:不同濃度的Pilocarpine和NPY以及DEX和insulin對(duì)ADSCs中NOVA1的表達(dá)未見影響，IBMX在處理1天時(shí)誘導(dǎo)NOVA1表達(dá)升高，3天和7天影響不明顯;吲哚美辛在誘導(dǎo)3天和7天時(shí)可顯著促進(jìn)NOVA1表達(dá)升高;而這種促進(jìn)作用會(huì)被GW9662所抑制。
　　研究結(jié)論:
　　1.ADSCs中表達(dá)多種RBPs，在其成脂分化過程中，hnRNPH1、

15、PTBP1、hnRNPH2、RBM38、FOXC2、NOVA1等RBPs表達(dá)發(fā)生變化，NOVA1變化差異最明顯，而NOVA1在ADSCs成骨以及成肌分化過程中表達(dá)無顯著變化，說明NOVA1在干細(xì)胞分化中的表達(dá)具譜系特異性;NOVA在脂肪組織中的表達(dá)較在其它組織中高。提示NOVA1在脂肪分化中發(fā)揮特異性作用。
　　2.NOVA1敲減促進(jìn)ADSCs凋亡，抑制其遷移。敲減NOVA1抑制ADSCs和BMSCs成脂分化過程中成脂相關(guān)基因的表

16、達(dá)與脂滴的形成，過表達(dá)NOVA1則有促進(jìn)作用，說明NOVA1參與調(diào)控MSCs成脂分化;但單純過表達(dá)NOVA1不能激活MSCs的成脂分化。
　　3.NOVA1通過作用于脂質(zhì)代謝相關(guān)基因以及UPR信號(hào)影響MSCs成脂分化，并且NOVA1可能與PTBP1作為復(fù)合體發(fā)揮作用。
　　4.NOVA1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在PPARγ應(yīng)答元件，PPARγ配體吲哚美辛和羅格列酮能夠促進(jìn)NOVA1的表達(dá)，這種促進(jìn)作用可被PPARγ拮抗劑GW9662