SREBP-1c在白藜蘆醇預(yù)防大鼠非酒精性脂肪肝發(fā)生中的作用.pdf

1、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，包含一系列從簡(jiǎn)單的脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎等臨床癥狀，甚至肝硬化[1，2]。在西方國(guó)家，NAFLD占據(jù)大多數(shù)的慢性肝病，有近30％的成年人和大多數(shù)肥胖人患有[3，4]。雖然大量的研究已經(jīng)進(jìn)行，但NAFLD的具體病理原因仍然在很大程度上未知[5]。一種改進(jìn)的“二次打擊”模式已經(jīng)總結(jié)出NAFLD的引發(fā)和進(jìn)展，其中胰島素抵抗被認(rèn)為是對(duì)肝臟的“一次打擊”，并導(dǎo)致接下來(lái)的打擊，包括氧化應(yīng)激，炎癥，纖維化和細(xì)胞凋

2、亡的發(fā)生[6]。
　　經(jīng)全面匯總分析[7]和詳盡的審查[8]，NAFLD的治療仍存在爭(zhēng)議。各種藥理學(xué)方法已被探索，主要側(cè)重于減輕重量，或者通過(guò)單純的生活方式干預(yù)或與藥物治療相結(jié)合。然而，除了持續(xù)減重，沒(méi)有其他單獨(dú)的介入已經(jīng)證明了對(duì)NAFLD的治療有明確的顯著療效[9，10]，這突出表明，需要新的方法用于NAFLD的預(yù)防和治療。
　　白藜蘆醇（3，4'，5-三羥基二苯乙烯）是一種自然的酚類化合物，存在于某些水果、蔬菜和飲料中，

3、包含紅葡萄酒。已有報(bào)告顯示白藜蘆醇具有很多的生物健康益處，包括抗氧化、抗衰老、抗癌癥、誘導(dǎo)自噬作用以及改善脂質(zhì)代謝[11，12]。在最近的動(dòng)物研究中，白藜蘆醇顯示出很有前景的效果在于保護(hù)肝臟抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚[13-16]。其作用機(jī)制可能是通過(guò)單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)抑制脂肪生成的相關(guān)基因(如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS))來(lái)預(yù)防和改善肝臟脂肪變性，最后，降低肝脂肪酸利用率。在NA

4、FLD的這些動(dòng)物模型中，動(dòng)物發(fā)展為肝臟炎癥，白藜蘆醇的抗炎潛力被認(rèn)為是該作用效果的核心機(jī)制。然而，更多的可能機(jī)制還是一個(gè)未知數(shù)。在本研究中，通過(guò)提高肝脂質(zhì)積聚的大鼠模型，我們探索白藜蘆醇在防治NAFLD方面的潛力，并深入探討白藜蘆醇對(duì)AMPK、SIRT1、SREBP-1c、FAS等基因表達(dá)的影響以及對(duì)轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　8周齡雄性SD大鼠110只隨機(jī)分為4組:基礎(chǔ)飼料對(duì)照組((C1，n=20)，高脂膳食

5、組(HF1，n=70)，高脂膳食加每天每kg體重50 mg RSV組(HF1RS0，n=10)和高脂膳食加每天每kg體重100 mg RSV組(HF1R100，n=10)。8周后，每組十只大鼠實(shí)施安樂(lè)死并取出肝臟和血液做后續(xù)分析。剩余HF1組大鼠被隨機(jī)分成六組，每組十只大鼠:基礎(chǔ)飼料對(duì)照組(HFC2)，高脂膳食組(HF2)，高脂膳食加每天每kg體重50 mg RSV組(HF2R50)，高脂膳食加每天每kg體重100 mg RSV組(HF

6、2R100)，基礎(chǔ)飼料加每天每kg體重50 mg RSV組(HFC2R50)，基礎(chǔ)飼料加每天每kg體重100 mg RSV組(HFC2R100)。繼續(xù)喂養(yǎng)8周后，所有大鼠實(shí)施安樂(lè)死并取出肝臟和血液做后續(xù)分析。每周稱量動(dòng)物體重和食物消耗量，干預(yù)后檢測(cè)血清和肝臟中脂質(zhì)含量，肝臟組織HE染色觀察脂肪變情況，Western blot檢測(cè)pAMPK、SIRT1、SREBP-1c、FAS的蛋白表達(dá)以及實(shí)時(shí)定量PCR分析SREBP-1c和FAS mR

7、NA表達(dá)，ChIP試驗(yàn)分析FAS啟動(dòng)子序列SRE與SREBP-1c的結(jié)合程度。
　　結(jié)果:
　　1.RSV干預(yù)對(duì)大鼠攝食量和體重的影響
　　通過(guò)8周的干預(yù)，HF1組大鼠體重顯著重于C1組(P＜0.05），由基礎(chǔ)飼料轉(zhuǎn)為高脂飼料后，大鼠的攝食量出現(xiàn)了不同程度的下降，說(shuō)明大鼠對(duì)不同能量密度和營(yíng)養(yǎng)素組成的食物有相應(yīng)的識(shí)別和自我調(diào)節(jié)能力，而RSV干預(yù)在不影響大鼠每日能量攝入的情況下能使高脂飼養(yǎng)大鼠體重下降（P＜0.05）。但5

8、0mg和100mg RSV干預(yù)未觀察到劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　2.RSV對(duì)大鼠脂代謝影響
　　脂代謝紊亂被普遍認(rèn)為是NAFLD的根本。 HF1組大鼠血清和肝臟中TC和TG的濃度顯著增加(P＜0.05)，而RSV干預(yù)能顯著削弱高脂膳食所引起的TG含量的升高（P＜0.05），但RSV對(duì)TC的影響較小。
　　3.白藜蘆醇能有效的減輕高脂誘導(dǎo)的NAFLD肝臟脂肪變性
　　由高脂飲食誘導(dǎo)8周后，HF1組大鼠肝臟出現(xiàn)了大量的脂肪

9、沉積，表明NAFLD的模型建立成功。為了評(píng)價(jià)白藜蘆醇對(duì)NAFLD進(jìn)展的預(yù)防效果，在給予高脂飲食的同時(shí)用白藜蘆醇干預(yù)，白藜蘆醇能夠顯著降低高脂膳食引起的肝細(xì)胞脂肪滴的沉積。進(jìn)一步為了研究白藜蘆醇是否對(duì)NAFLD具有治療作用，將高脂喂養(yǎng)8周NAFLD建模成功的大鼠隨機(jī)分成六組:基礎(chǔ)飼料對(duì)照組(HFC2)、高脂膳食組(HF2)、高脂膳食RSV組(HF2R50、HF2R100)、基礎(chǔ)飼料加RSV組(HFC2R50、HFC2R100)，繼續(xù)喂養(yǎng)8

10、周后，HF2組大量的肝細(xì)胞脂肪變性，且具有明顯氣球樣變。HF2組的NAS量化評(píng)分顯著高于C2組，HF2組的小葉內(nèi)炎癥和纖維化程度非常高;HFC2組的NAS量化評(píng)分顯著低于HF2組，HFC2組的纖維化程度明顯降低了;HFC2R50和HFC2R100組的NAS量化評(píng)分顯著低于HFC2組，特別是HFC2R50和HFC2R100組的小葉內(nèi)炎癥明顯改善;HF2R50和HF2R100組的NAS量化評(píng)分顯著高于HFC2R50和HFC2R100組，它們

11、的脂肪變性和小葉內(nèi)炎癥情況相對(duì)嚴(yán)重;但只要添加了白藜蘆醇干預(yù)或者從高脂膳食轉(zhuǎn)變?yōu)檎Ｉ攀?，都?huì)改善肝臟脂肪變性程度。NAS量化評(píng)分與H&E染色結(jié)果是一致的。這些結(jié)果表明，白藜蘆醇有效地改善由高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性。
　　4.白藜蘆醇誘導(dǎo)SD大鼠肝臟中AMPK的激活，增加SIRT1的表達(dá)水平
　　為了驗(yàn)證白藜蘆醇對(duì)肝臟的保護(hù)效應(yīng)是否通過(guò)AMPK和SIRT1信號(hào)通路，進(jìn)一步檢測(cè)肝臟組織中AMPK和SIRT1的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯

12、示:高脂喂養(yǎng)SIRT1的蛋白表達(dá)水平、AMPK-Thr172位點(diǎn)的磷酸化水平顯著降低，白藜蘆醇干預(yù)后能夠有效逆轉(zhuǎn)蛋白水平的降低。
　　5.白藜蘆醇抑制SREBP-1c基因表達(dá)
　　為了檢驗(yàn)白藜蘆醇干預(yù)可能抑制NAFLD大鼠肝臟中過(guò)度活躍的SREBP-1c，我們檢測(cè)了SREBP-1c的蛋白表達(dá)，在NAFLD大鼠肝臟中SREBP-1c的積累被白藜蘆醇干預(yù)后顯著減少。在HF飲食下肝臟SREBP-1 c的mRNA水平被顯著增加，并且

13、這種作用完全被白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，白藜蘆醇下調(diào)肝臟SREBP-1c表達(dá)，從而減少肝組織TG合成。
　　6.白藜蘆醇抑制SREBP-1c表達(dá)，抑制SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄活性及其靶基因的表達(dá)
　　為了確定通過(guò)白藜蘆醇干預(yù)抑制SREBP-1c后的結(jié)果，通過(guò)Western印跡法，定量RT-PCR和ChIP實(shí)驗(yàn)評(píng)估SREBP-1c在肝臟中的關(guān)鍵靶點(diǎn)FAS基因的表達(dá)。白藜蘆醇顯著抑制FAS的啟動(dòng)子SRE與SREBP-1c的結(jié)合程