樺褐孔菌多糖的化學(xué)修飾、理化性質(zhì)及生物活性研究.pdf

1、樺褐孔菌（Inonotus obliquus）屬于擔(dān)子菌亞門，是一種非常珍稀并且有著非凡治療效果的可食藥用真菌，其主要分布在北緯45-50°的寒冷地區(qū)，如歐洲、亞洲和北美地區(qū)，是生長(zhǎng)在寒帶的木腐菌。樺褐孔菌含有多種化學(xué)成分，如多糖、多酚、樺褐孔菌醇、多種氧化三萜類化合物等，具有良好的藥效價(jià)值。樺褐孔菌多糖是一種重要的生物活性物質(zhì)，它具有抗自由基氧化、降血糖、抗衰老等多種活性，且對(duì)人體無副作用。然而天然的樺褐孔菌資源非常有限，價(jià)格昂貴，直

2、接從野生樺褐孔菌中提取生物活性物質(zhì)成本很高且不利于自然資源的保護(hù)。因此為了滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，我們采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的方法獲取樺褐孔菌胞內(nèi)多糖(IPS)、胞外多糖(EPS)，縮短其生長(zhǎng)周期來獲取活性多糖。樺褐孔菌的液體培養(yǎng)條件影響多糖的產(chǎn)生和理化性質(zhì)，本論文比較研究1）對(duì)照培養(yǎng)基、2）表面活性劑促進(jìn)作用下的、3）木質(zhì)纖維素降解刺激作用下的液體發(fā)酵多糖的硫酸化修飾。
　　多糖生物活性與其結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行

3、適當(dāng)修飾是多糖領(lǐng)域研究的重點(diǎn)方向之一。多糖的結(jié)構(gòu)修飾是指通過化學(xué)、物理等手段對(duì)多糖分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，從而獲得不同理化性質(zhì)甚至產(chǎn)生新的生物活性的多糖衍生物。硫酸化多糖是一類糖羥基上含有硫酸根的多糖。多糖經(jīng)硫酸酯化的修飾后，其構(gòu)象發(fā)生了變化，而構(gòu)象的變化是生物活性變化的決定因素。許多文獻(xiàn)研究表明，多糖經(jīng)過硫酸化修飾后，其生物活性往往增強(qiáng)了甚至有時(shí)會(huì)出現(xiàn)新的生物活性。本文分別對(duì)三種不同來源的樺褐孔菌胞內(nèi)、胞外多糖進(jìn)行了硫酸化修飾，并且比較了它

4、們的抗氧化活性和相關(guān)理化性質(zhì)，初步探討構(gòu)效關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
　　1、硫酸化修飾條件的確定
　　以取代度為指標(biāo)，對(duì)照培養(yǎng)基發(fā)酵第九天的胞外多糖為樣品，通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳硫酸化修飾條件為溫度75℃，時(shí)間為2.5h，摩爾比為1:2.5。
　　2、硫酸化對(duì)多糖理化性質(zhì)的影響
　　在三種不同來源培養(yǎng)基中，添加以麥稈為木質(zhì)纖維素來源的培養(yǎng)基胞外多糖（EPSws）和胞內(nèi)多糖（IPSws）提取物有最高的糖醛酸含

5、量和多酚含量，其含量分別為7.92％、8.74%和2.29%、5.69%，同時(shí)含有最高的胞外糖含量和蛋白含量，分別為36.28%和25.77%；添加Tween80為表面活性劑的培養(yǎng)基能促進(jìn)胞外多糖（EPSt80）、胞內(nèi)多糖（IPSt80）提取物的糖含量和糖醛酸含量的產(chǎn)生。對(duì)照培養(yǎng)基（ct-）的胞內(nèi)多糖（IPSct）有最高的胞內(nèi)蛋白含量，添加木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基能促進(jìn)胞外蛋白質(zhì)含量增加，但降低了胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量，而添加Tween80培養(yǎng)基胞內(nèi)、

6、胞外蛋白質(zhì)含量都降低了。
　　三種不同來源培養(yǎng)基多糖在最佳硫酸化修飾條件下進(jìn)行修飾后，樣品分別為sEPSct, sEPSws, sEPSt80, sIPSct, sIPSws, sIPSt80，在同樣的修飾條件下，胞外多糖的取代度要比對(duì)應(yīng)胞內(nèi)多糖的取代度高。其各自的化學(xué)組分含量都降低了。
　　EPSct和sEPSct的分子量幾乎是其他多糖的一倍多，MW/MN的值要比其他各多糖的值更小，且其值接近1，表明EPSct與sEPSc

7、t比其他多糖分子更均一。
　　3、硫酸化修飾對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的影響
　　單糖組成分析中，所有多糖主要由甘露糖，葡萄糖和半乳糖組成，同時(shí)還有少量的鼠李糖，阿拉伯糖和木糖。對(duì)于胞外多糖，添加木質(zhì)纖維素的培養(yǎng)基含有最高的甘露糖，含量為32.6%，而添加Tween80的培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基甘露糖含量分別為28.1%和16.3%。對(duì)于胞內(nèi)多糖，添加木質(zhì)纖維素和Tween80的培養(yǎng)基有更高含量的葡萄糖，其含量分別為65.3%和65.8%。同時(shí)，

8、三種不同來源培養(yǎng)基的胞內(nèi)、胞外多糖經(jīng)硫酸化修飾后，葡萄糖含量都比對(duì)應(yīng)天然多糖的含量要高。
　　觀察三種不同來源培養(yǎng)基多糖的分子形貌，EPSct的分子形貌要更均一，且更細(xì)??；EPSws的分子形貌則更圓滑且有較多圓柱形塊狀體；EPSt80分子形貌比較密集，分子大都呈現(xiàn)針狀，且經(jīng)硫酸化修飾后，sEPSt80的分子形貌更光滑，并出現(xiàn)較多的塊狀柱體。
　　4、硫酸化修飾對(duì)多糖抗氧化活性的影響
　　胞外多糖的DPPH自由基清除率活

9、性大?。簊EPSws>sEPSt80>EPSws>EPSt80>sEPSct>EPSct；胞內(nèi)多糖的活性大小：sIPSws>sIPSt80>IPSws>IPSt80>sIPSct>IPSct。硫酸化修飾多糖要比各自對(duì)應(yīng)的天然多糖IC50值要低，其中sEPSws的IC50值最低，為1.65mg/mL。
　　綜上結(jié)果表明，在木質(zhì)纖維素降解刺激作用下和Tween80表面活性劑促進(jìn)作用下所產(chǎn)生的樺褐孔菌多糖的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)不同于對(duì)照培養(yǎng)基