樺褐孔菌多糖降糖成分篩選及結構鑒定.pdf

1、目的:以樺褐孔菌為原料，提取樺褐孔菌多糖（IOP），分離純化得到樺褐孔菌均一多糖。篩選降糖活性較高的成分，測定其分子量和單糖組成，然后對其結構進行鑒定，并考察其抗氧化、抑菌及免疫調節(jié)的生物活性。
　　方法:（1）采用水提醇沉法，提取IOP，以IOP的提取率為考察指標，優(yōu)化IOP的提取工藝；利用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法分別測定樺褐孔菌粗多糖中的多糖含量和蛋白質含量。（2）利用柱色譜的方法對提取得到的樺褐孔菌粗多糖進行分離純化，樺褐

2、孔菌粗多糖經大孔吸附樹脂柱純化后，采用DEAE-纖維素柱進行分離。（3）采用高效凝膠滲透色譜-蒸發(fā)光檢測法測定各部分多糖的純度和分子量，采用PMP柱前衍生法測定IOP的單糖組成。（4）采用HepG2細胞作為體外受體模型，研究不同濃度的5種樺褐孔菌均一多糖對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響，篩選降糖活性較高的成分。（5）應用高效液相色譜、高碘酸氧化和 Smith降解、甲基化分析以及紅外光譜等化學和儀器分析方法，對IOP的結構進行研究。（6）

3、采用化學分析方法測定樺褐孔菌均一多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基的清除能力，檢測其體外抗氧化活性。（7）采用藥敏紙片法測定IOP對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌和綠膿桿菌的抑菌作用，并采用倍比稀釋法，測定其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。（8）通過檢測IOP對小鼠脾細胞體外增殖影響，探討IOP對免疫功能調節(jié)的作用。
　　結果:（1）在單因素試驗的基礎上，通過響應面優(yōu)化得到IOP提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比1:22

4、，提取時間2.5 h，提取溫度90℃。IOP的提取率達到13.43％。粗多糖中多糖含量為19.43%，蛋白質含量為9.70%。（2）樺褐孔菌粗多糖經大孔吸附樹脂柱純化后，采用 DEAE-纖維素柱進行分離得到5個均一多糖 IOP1、IOP2、IOP3、IOP4和IOP5。（3）5個樺褐孔菌均一多糖的分子量分別為3.39×105 Da、7.90×105 Da、4.26×105 Da、1.82×106 Da和9.66×105 Da。IOP1是

5、由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara組成，其摩爾比為5.37:3.61:1.00:1.13:8.78:14.83:3.41:1.91；IOP2是由Man、Rha、GlcA、Glc、Gal、Xyl和Ara組成，其摩爾比為3.63:1.00:1.79:1.90:6.38:3.26:3.79；IOP3是由Man、Rha、GalA、Gal、Xyl和Ara組成，其摩爾比為4.47:1.71:2.98:2.31:1.

6、24:1.00；IOP4是由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc和Xyl組成，其摩爾比為6.41:3.45:1.00:1.20:10.21:11.51；IOP5是由Man、Rha、GalA、Gal、Xyl和Ara組成，其摩爾比為3.70:1.00:1.44:1.48:1.23:1.62。（4）不同濃度的IOP1、IOP2、IOP3、IOP4和IOP5均能促進HepG2細胞對培養(yǎng)液中葡萄糖的攝取，其中以IOP1的作用效果最好。當IO

7、P1濃度為0.25 mg·mL-1時，作用效果最好。IOP1、IOP2、IOP3、IOP4和IOP5在0.25 mg·mL-1時均能促進胰島素抵抗細胞模型的葡萄糖消耗，且隨著時間的延長細胞的葡萄糖消耗逐漸增加，且以IOP1的作用最顯著。（5）通過高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析、紅外光譜等方法研究樺褐孔菌均一多糖結構，得到了IOP1糖殘基的各種連接方式，且IOP1主鏈主要由Glc和Gal構成。（6）IOP具有顯著的清除自由基能力，

8、并呈一定的量效關系。在IOP濃度較高的條件下，對羥基自由基及DPPH的清除能力較為顯著，對超氧陰離子的清除能力次之。（7）不同濃度的IOP的抑菌效果為金黃色葡萄球菌>枯草桿菌>大腸桿菌>綠膿桿菌。對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為12.5 mg·mL-1，對大腸桿菌、枯草桿菌和綠膿桿菌的最低殺菌濃度為25 mg·mL-1。（8）IOP高中劑量組對ConA誘導的脾細胞增殖均有顯著的促進作用，而低劑量組體外能抑制ConA誘導的脾細胞增殖作用；