牛病毒性腹瀉病毒持續(xù)性感染的分子機(jī)制研究及其定點(diǎn)突變株的構(gòu)建.pdf

1、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是造成豬、牛、羊和鹿等家畜動(dòng)物和部分野生動(dòng)物的牛病毒性腹瀉-黏膜?。╞ovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）的主要病原體。該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，對畜牧業(yè)的健康發(fā)展和牛源生物制品（血清和凍精等）質(zhì)量提高等造成巨大的威脅。但是，目前我國尚無有效的藥物和防控措施抵御 BVDV感染，其主要原因之一是 BVD

2、V持續(xù)性感染的分子機(jī)制尚未系統(tǒng)闡明。而大量的研究表明細(xì)胞自噬和凋亡等信號通路直接影響病毒持續(xù)性感染，而且 microRNA（miRNA）也能通過調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡等信號通路進(jìn)而影響病毒持續(xù)性感染，所以本研究全面探索 BVDV、miRNA、自噬和凋亡之間相互作用的分子機(jī)制，為闡明 BVDV持續(xù)性感染的分子機(jī)制提供理論依據(jù)；同時(shí)通過定點(diǎn)突變和反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建 BVDV定點(diǎn)突變株，為研發(fā)抗 BVDV有效方法奠定了技術(shù)和理論支持，也為家畜的抗

3、病育種工作提供新的方法和理論依據(jù)。
　　目的：本研究以 BVDV標(biāo)準(zhǔn)株 NADL為研究對象，探索 BVDV NADL調(diào)控宿主細(xì)胞 MDBK的細(xì)胞自噬和凋亡通路及自噬改變對 BVDV NADL復(fù)制影響的分子機(jī)制，并探索利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建定點(diǎn)突變性 BVDV毒株。（1）探索 BVDV NADL影響 MDBK細(xì)胞自噬的分子機(jī)制；（2）探討 MDBK細(xì)胞自噬水平改變后對 BVDV復(fù)制的影響；（3）探究 miR-29b對 BVDV NA

4、DL感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬及 BVDV NADL復(fù)制的影響；（4）分析 miR-29b對 MDBK細(xì)胞凋亡的影響；（5）使用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救定點(diǎn)突變型 BVDV毒株。通過本研究的開展，為系統(tǒng)闡述 BVDV持續(xù)性感染的分子機(jī)制、開發(fā)防控 BVDV的新方法和家畜的抗病育種工作奠定理論依據(jù)。
　　方法：（1）BVDV NADL感染 GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 MDBK細(xì)胞，在處理后不同時(shí)間，采用實(shí)時(shí)定量 PCR、Western blot、激

5、光共聚焦顯微鏡和透射電鏡等方法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平和自噬活性變化；并構(gòu)建紅色熒光標(biāo)記的 BVDV NADL三個(gè)糖蛋白 Erns、E1和 E2基因過表達(dá)的慢病毒，使用相同方法檢測糖蛋白過表達(dá)對細(xì)胞自噬活性的影響；（2）使用自噬抑制劑、促進(jìn)劑和 RNA干擾技術(shù)分別處理 MDBK細(xì)胞，檢測細(xì)胞自噬水平的變化；并使用 BVDV NADL感染自噬活性改變的 MDBK細(xì)胞，檢測 BVDV NADL mRNA水平變化；（3）預(yù)測并鑒定 miR

6、-29b在自噬信號通路中靶基因 ATG14和 ATG9A；檢測 pre-miR-29b過表達(dá)的慢病毒和 BVDV NADL感染后靶蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞自噬水平及 BVDV NADL復(fù)制水平；并設(shè)計(jì) ATG14和 ATG9A回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-29b通過下調(diào)靶蛋白 ATG14和 ATG9A的表達(dá)，進(jìn)而影響B(tài)VDV NADL感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平和 BVDV的復(fù)制；（4）預(yù)測和鑒定 miR-29b在凋亡信號通路中的靶基因 NAIF1

7、和 caspase-7；檢測 miR-29b模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染后 MDBK細(xì)胞凋亡水平及 caspase-7和 NAIF1 mRNA和蛋白表達(dá)水平；并設(shè)計(jì)caspase-7和 NAIF1回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明 miR-29b通過下調(diào) caspase-7和 NAIF1的表達(dá)，進(jìn)而影響凋亡水平；（5）構(gòu)建 T7 RNA聚合酶基因過表達(dá)的慢病毒，并感染 MDBK細(xì)胞；使用嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)篩選；檢測 T7RNAP表達(dá)水平和 T7 RNA聚合酶

8、活性；傳至40代，鑒定 MDBK-T7RNAP細(xì)胞的穩(wěn)定性；并以 pACNR/NADL質(zhì)粒為模板，使用定點(diǎn)突變試劑盒突變 E2和 NS4B基因位點(diǎn)；轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒至 MDBK-T7RNAP細(xì)胞中，拯救定點(diǎn)突變株，并檢測 BVDV定點(diǎn)突變株復(fù)制水平的變化；并傳代鑒定其遺傳穩(wěn)定性。
　　結(jié)果：（1）BVDV NADL感染及 Erns和 E2過表達(dá)都能顯著性增加自噬體/自噬溶酶體的數(shù)量、GFP-LC3 puncta數(shù)量、Beclin1和

9、ATG14 mRNA和蛋白水平；（2）3-MA、渥曼青霉素和 RNA干擾能抑制細(xì)胞自噬活性和 BVDV NADL的復(fù)制；相反地，rapamycin處理能顯著性促進(jìn)細(xì)胞自噬和增加 BVDV NADL復(fù)制；當(dāng) BVDV NADL感染18 h后，5’UTR轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)降低，加入溶酶體抑制劑氯喹，其轉(zhuǎn)錄水平又出現(xiàn)升高；（3）miR-29b能特異性靶向 ATG14和 ATG9A的3’UTR區(qū)并抑制其表達(dá)；同時(shí)miR-29b高表達(dá)能顯著性降低 BV

10、DV NADL的復(fù)制水平及其感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬；ATG14和 ATG9A表達(dá)回復(fù)后，BVDV NADL復(fù)制水平和 BVDV NADL感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平又出現(xiàn)升高；（4）miR-29b降低了 MDBK細(xì)胞凋亡水平；miR-29b能直接靶向 NAIF1和 caspase-73’UTR并抑制其表達(dá)；NAIF1和 caspase-7過表達(dá)后顯著性增加細(xì)胞凋亡水平；（5）成功篩選獲得具有較強(qiáng)的 T7 RNA聚合酶活性和較好穩(wěn)定性的MDBK-T

11、7RNAP細(xì)胞；并成功構(gòu)建 E2和 NS4B突變的 BVDV毒株 BVDV E2M和NS4BM；與親本株相比，BVDV E2M和 NS4BM mRNA復(fù)制水能力和增殖能力有所下降。
　　結(jié)論：（1）BVDV NADL感染及 Erns和 E2過表達(dá)能顯著性增加細(xì)胞自噬的活性，首次闡明 BVDV感染對自噬的影響及其分子機(jī)制；（2）細(xì)胞自噬水平下降后阻止了BVDV NADL復(fù)制；早期自噬水平上調(diào)后增加了 BVDV NADL的復(fù)制；闡述了

12、自噬改變對 BVDV復(fù)制的影響，也進(jìn)一步為闡明 BVDV持續(xù)性感染的分子機(jī)制奠定理論依據(jù)；（3）miR-29b直接靶向自噬相關(guān)蛋白 ATG14和 ATG9A并抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制BVDV NADL感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和 BVDV NADL復(fù)制，闡明了 miR-29b通過影響自噬進(jìn)而影響 BVDV復(fù)制的分子機(jī)制；（4）miR-29b直接靶向凋亡相關(guān)蛋白 caspase-7和 NAIF1并抑制其表達(dá)，進(jìn)而降低 MDBK細(xì)胞凋亡水平，闡明 mi