牛病毒性腹瀉病毒套式RT-PCR分型檢測方法的建立及初步應用的研究.pdf

1、牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVD/MD),簡稱牛病毒性腹瀉(BVD),是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)感染牛引起的以發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、持續(xù)性感染與免疫耐受及懷孕母牛流產、產死胎和畸形胎等為主要特征的一種傳染病。牛病毒性腹瀉病毒在世界各國普遍存在,給畜牧業(yè)造成了巨大的經濟損失。目前,國內已有20多個省、市、自治區(qū)報道存在BVDV感染。
　　 BVDV的檢測方法大體分為血清學檢測和病原學檢測兩種,以病原診斷為主,通常

2、聯(lián)合使用可獲得理想效果。本研究從病原診斷入手,利用分子生物軟件比對Genbank上已發(fā)表的BVDV全基因組序列,同時參考已發(fā)表文獻,分別在基因組5'UTR和非結構蛋白NS5B兩處基因相對保守區(qū),設計合成兩套套式RT-PCR引物分型檢測BVDV核酸。經試驗表明,兩套引物均能夠對BVDV分型檢測。綜合比較引物的優(yōu)勢后,選取了NS5B區(qū)的引物建立套式RT-PCR檢測方法。參考已發(fā)表文獻,使用外源基因EGFP作為內部參照,設計合成了一系列引物獲

3、得大小不等的EGFP片段,比較試驗選取了適合于本實驗的片段引入反應體系中,并優(yōu)化反應條件,以達到監(jiān)控RT-PCR和PCR整個反應過程,結合陰性對照,使得檢測結果準確真實。本實驗結果表明,該方法相比商品化試劑盒在血清樣品檢測上更靈敏,最低可檢測出10-4TCID50的病毒核酸,核酸最低檢出量為2.6pg,且相比國內已報道的RT-PCR檢測方法更為敏感。特異性試驗表明本方法可以將BVDV與同屬的豬瘟病毒及其他臨床癥狀相似的牛病病原體區(qū)分開。

4、應用本方法對東北地區(qū)四個不同奶牛養(yǎng)殖場共322份血清和132份奶液樣品進檢測,部分樣品與商品化抗原捕獲ELISA試劑盒的檢測結果進行比較,符合率較低。后將陽性樣品接種長滿單層的MDBK細胞,盲傳兩代后再使用RT-PCR復檢并測序,結果符合率100％。表明所建立的套式RT-PCR方法可以用于BVDV臨床檢測和流行病學監(jiān)測。診斷結果結果顯示所檢牛場存在著BVDV感染。
　　 綜上,本研究提供了一套切實可行、簡便快捷且成本相對較低的牛