牛病毒性腹瀉病毒p80蛋白單抗制備與表位鑒定及LJ36-14毒株的分離鑒定.pdf

1、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)可引起牛病毒性腹瀉/粘膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease, BVD/MD)。感染BVDV的牛臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、采食量下降、大量流涎、腹瀉、口腔黏膜充血潰瘍，孕牛表現(xiàn)為流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒或產(chǎn)出持續(xù)感染牛，新生犢牛因嚴(yán)重腹瀉而死亡。目前 BVDV在世界范圍內(nèi)流行，引起各個(gè)國(guó)家的高度關(guān)注。BVDV也是組織細(xì)

2、胞培養(yǎng)及生物制品中最為常見的外源性病毒。根據(jù)BVDV5'非編碼區(qū)(5'UTR)的不同可以分為BVDV-1型和BVDV-2型兩個(gè)基因型。不同基因型又進(jìn)一步分為不同的基因亞型。根據(jù)接種細(xì)胞后能否產(chǎn)生細(xì)胞病變，BVDV分為致細(xì)胞病變型(CP)和非致細(xì)胞病變型(NCP)。若懷孕母牛感染NCP型BVDV后，會(huì)導(dǎo)致胎兒免疫耐受，胎兒或繼續(xù)發(fā)育或流產(chǎn)，即使順利產(chǎn)出也會(huì)成為持續(xù)感染(PI)牛，可持續(xù)向外界排毒，成為BVDV主要的傳染源。而目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)商

3、品化的檢測(cè)試劑和相關(guān)疫苗。
　　p80蛋白是BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白之一，在瘟病毒屬中是一種突變率很低的非常保守的免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，具有重要的診斷價(jià)值。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)，成功誘導(dǎo)表達(dá)出p80重組蛋白，免疫印跡表明其具有良好的反應(yīng)性。利用濃縮的BVDV病毒液免疫6~8周齡Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞在PEG的作用下進(jìn)行融合，經(jīng)過(guò)純化的重組p80蛋白包被的ELISA篩選和三次亞克隆后，獲得8株穩(wěn)定分泌針對(duì)BVDV的

4、p80蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別為3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11；8株雜交瘤細(xì)胞株接種Balb/c小鼠制備腹水，效價(jià)為1×105-1×107；間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)表明8株雜交瘤細(xì)胞所分泌的MAb具有良好的反應(yīng)性和特異性；8株單抗的抗體亞類均為IgM/κ。本研究制備的重組p80蛋白單克隆抗體可試用于建立檢測(cè)BVDV抗原的診斷方法。利用pGEX-6p-1原核表達(dá)載體，表達(dá)一系列部分重疊的p80蛋白的短肽

5、，通過(guò)對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blot分析，初步確定p80蛋白的抗原表位區(qū)域位于p80蛋白的446—558位氨基酸。
　　BVDV亞型較多，不同地區(qū)流行不同的亞型，給 BVDV的防控帶來(lái)的巨大挑戰(zhàn)。本研究對(duì)2014年從黑龍江省發(fā)生牛呼吸道傳染病的某肉牛場(chǎng)采集的40份鼻拭子進(jìn)行了病毒分離，成功分離到一株 BVDV，命名為L(zhǎng)J36/14株。病毒鑒定結(jié)果表明，分離株在 MDBK細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變。用BVDV的p80蛋白的MAb(3

6、G2)進(jìn)行的間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）表明接種LJ36/14株的細(xì)胞顯示特異性綠色熒光。病毒滴定其TCID50為105.9/0.1mL。對(duì)LJ36/14分離株的5‘端非編碼區(qū)（5’UTR）和Npro基因進(jìn)化樹分析表明該毒株為一新的基因亞型，定為BVDV1v亞型。
　　綜上所述，本研究成功制備了8株BVDV單抗，IFA表明單抗與BVDV具有良好的反應(yīng)性和特異性，可試用于建立檢測(cè)BVDV抗原的診斷方法。初步鑒定了p80蛋白的抗原表位區(qū)