抗菌肽P3類似物JH-3的篩選及抗菌作用研究.pdf

1、傳統(tǒng)抗生素的濫用，臨床上多種耐藥菌株、超級細菌等的出現(xiàn)，對畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及人類健康造成了極大的威脅。研制高效廣譜抗菌、不易產(chǎn)生耐藥性，且對機體低毒甚至無毒的新型抗菌藥物，以替代傳統(tǒng)抗生素，成為一項迫切的任務。在開發(fā)新型抗菌藥物的過程中，抗菌肽以其廣譜的抗菌活性進入人們的視野，并逐漸成為研究的熱點?？咕氖巧矬w在抵抗外來微生物入侵時產(chǎn)生的一類防御性小肽，是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、水溶性

2、好、熱穩(wěn)定性好，抗菌機理獨特，對臨床耐藥細菌具有廣譜的抗菌活性，且不易誘發(fā)細菌產(chǎn)生耐藥性等特點。隨著研究的進一步深入，人們還發(fā)現(xiàn)抗菌肽不僅具有良好的抗菌活性，還表現(xiàn)出良好的抗病毒、抗真菌、選擇性抑制腫瘤細胞生長等生物活性，并且對動物體的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。
　　本研究中，以本課題組由牛紅細胞血紅蛋白α亞基中分離到的抗菌肽P3為研究對象。通過對其進行氨基酸序列分析、分子設計等，以提高其殺菌活性，并對其溶血性、細胞毒性、特異性

3、選擇抑制Hela細胞活性進行分析。通過CD掃描，對P3進行結構分析；采用膜滲透性、掃描電鏡觀察、膜電位檢測等試驗，對P3的膜破壞機制進行初步的探索。分析P3進入細胞后對細胞內(nèi)液中鈣離子濃度平衡的干擾作用。結合P3的膜-肽作用機制，以闡明P3的殺菌機制。并通過構建ICR小鼠感染模型，對P3及其類似物在小鼠體內(nèi)的抗感染活性進行研究。
　　為了增強P3的抑菌活性，通過結構優(yōu)化設計了四條P3類似物序列，分別命名為JH-0、JH-1、JH-

4、2、JH-3。與P3相比，四種類似物對五種測試菌株的MIC值均有不同程度的升高，且溶血性、細胞毒性較小，其中JH-3對癌細胞Hela表現(xiàn)出良好的選擇性抑制活性。膜-肽作用機制分析發(fā)現(xiàn)：P3在細菌磷脂膜模擬環(huán)境下，自身形成α-螺旋結構；P3作用于細菌后，導致細菌細胞膜的通透性增加，并在細胞膜表面形成孔洞樣結構、區(qū)域性裂解，對細胞膜的生理結構形成物理性損傷，并造成細胞生理性膜電位的去極化。同時P3進入細胞內(nèi)，引起胞漿內(nèi)的鈣震蕩，造成鈣超載。

5、P3通過對細胞膜以及細胞內(nèi)多樣化的作用方式最終導致細菌死亡。
　　ICR小鼠體內(nèi)毒性試驗發(fā)現(xiàn)：P3及其類似物在小鼠體內(nèi)的LD50均高于臨床常用藥物PMB，而且小鼠對腹腔注射時抗菌肽的吸收率優(yōu)于皮下注射。P3及其類似物對臨床耐藥菌感染ICR小鼠的保護率均大于60％，其中JH-3對感染小鼠的保護率高達90％，而Amp組和空白組的小鼠在20h內(nèi)全部死亡。并且在注射后2h，P3及其類似物可有效降低小鼠血液中的菌落含量，以JH-3組差異極其