法尼基焦磷酸合成酶在心血管重塑中的作用研究.pdf

1、第一部分法尼基焦磷酸合成酶過表達(dá)導(dǎo)致心肌肥厚和心力衰竭
　　 研究背景:
　　 心肌肥厚和充血性心力衰竭是全世界人類死亡的主要原因之一。心肌肥厚是心力衰竭早期心肌細(xì)胞對室壁應(yīng)力增加的一種重要的適應(yīng)性、代償性反應(yīng)，最終會導(dǎo)致充血性心力衰竭。
　　 法尼基焦磷酸合成酶(famesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS)是甲羥戊酸途徑中的一種關(guān)鍵酶，它催化合成異戊二烯化產(chǎn)物，包括法尼基焦磷酸(FP

2、P)和牻牛兒牻牛兒焦磷酸(GGPP)。最新的研究表明FPPS在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌肥厚細(xì)胞中以及自發(fā)性高血壓大鼠中表達(dá)明顯增高，同時在自發(fā)性高血壓大鼠中抑制FPPS可以減輕心肌肥厚和改善血管重塑。這些結(jié)果都與RhoA相關(guān)，而GGPP對RhoA的牻牛兒牻牛兒焦磷酸化和活化非常重要。
　　 目的:
　　 本研究利用轉(zhuǎn)基因動物模型來進(jìn)一步探討FPPS與心肌肥厚和心力衰竭的關(guān)系，并研究其機(jī)制。
　　 方法:

3、
　　 (1)構(gòu)建心臟特異性過表達(dá)FPPS轉(zhuǎn)基因模型。
　　 (2)使用real-time PCR、western-blot、免疫組化等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中FPPS表達(dá)水平。
　　 (3)使用高效液相色譜法(HPLC)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中FPP和GGPP水平，酶法測定組織膽固醇濃度。
　　 (4)使用超聲心動圖、病理染色、心導(dǎo)管等方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能及形態(tài)學(xué)變化。
　　 (5

4、)使用real-time PCR技術(shù)檢測小鼠心臟心肌肥厚基因(ANP、BNP、β-MHC)以及心肌纖維化基因(TGF-β、CTGF)表達(dá)。
　　 (6)使用G-Lisa方法檢測小鼠心臟RhoA、Rac1、Cdc42、Ras等小G蛋白表達(dá)水平，使用western-blot方法檢測小鼠心臟Erkl/2、P38 MAPK、Akt/GSK3β等的活性。
　　 (7)表達(dá)FPPS的腺病毒感染心肌細(xì)胞，免疫熒光鑒定心肌細(xì)胞表面積。F

5、PPS抑制劑阿倫磷酸鈉或者Rho的抑制劑C3 exoenzyme、Ras抑制劑farnesylthiosalicylic acid(FTS)在感染后加入心肌細(xì)胞。
　　 (8)在腺病毒感染的心肌細(xì)胞中檢測RhoA、Ras、Erkl/2、P38 MAPK、Ak/GSK3β等活性。
　　 (9)使用HPLC技術(shù)檢測心肌細(xì)胞中FPP和GGPP水平，酶法測定細(xì)胞膽固醇濃度。
　　 結(jié)果:
　　 (1)轉(zhuǎn)基因小鼠心

6、臟組織中FPPS表達(dá)明顯增加。
　　 (2)心臟特異性表達(dá)FPPS增加了FPP和GGPP、膽固醇合成。
　　 (3)心臟特異性表達(dá)FPPS誘導(dǎo)心肌肥厚基因(ANP、BNP、β-MHC)、心肌纖維化基因(TGF-β、CTGF)表達(dá)增高，最終導(dǎo)致心肌肥厚、纖維化、心力衰竭。
　　 (4)心肌細(xì)胞腺病毒過表達(dá)FPPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚基因表達(dá)、細(xì)胞體積增大。心肌細(xì)胞中加入阿倫磷酸鈉或者C3 exoenzyme可抑制FPP

7、S過表達(dá)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大。
　　 (5)心臟特異性表達(dá)FPPS誘導(dǎo)RhoA活性增高，磷酸化的ERK和p38表達(dá)上調(diào)，與體內(nèi)結(jié)果一致，心肌細(xì)胞腺病毒過表達(dá)FPPS導(dǎo)致RhoA活性增高，磷酸化的ERK和p38表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 FPPS及FPPS調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心肌重塑過程中具有重要的作用。
　　 第二部分體內(nèi)抑制法尼基焦磷酸合成酶改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚和纖維化
　　 研究背

8、景:
　　 血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是一種血管加壓素，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的八肽激素中間體。相當(dāng)多的證據(jù)表明，AngⅡ在心肌肥厚和纖維化起著重要的作用。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)FPPS的表達(dá)水平在AngⅡ刺激的肥厚心肌細(xì)胞中顯著增加，這表明FPPS在AngⅡ引起的心肌肥厚中發(fā)揮著重要的作用。另外也研究發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中通過小分子RNA干擾抑制FPPS基因表達(dá)或者藥物阿倫磷酸鈉抑制FPPS可以阻止AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

9、。
　　 目的:
　　 本研究觀察抑制FPPS對體內(nèi)AngⅡ介導(dǎo)的心肌肥厚和纖維化的影響，并探討其機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)野生型小鼠分為四組:生理鹽水，血管緊張素Ⅱ（2.88毫克/公斤/天），阿倫磷酸鈉（0.1毫克/公斤/天），或血管緊張素Ⅱ（2.88毫克/公斤/天）和阿倫磷酸鈉（0.1毫克/公斤/天）持續(xù)微泵注射4周。
　　 (2)使用real-time PCR、western-blo

10、t等技術(shù)檢測各組小鼠心臟組織中FPPS表達(dá)水平。
　　 (3)使用HPLC技術(shù)檢測各組小鼠心臟組織中FPP和GGPP水平。
　　 (4)使用超聲心動圖、病理染色等方法檢測各組小鼠心臟功能及形態(tài)學(xué)變化。
　　 (5)使用real-time PCR技術(shù)檢測各組小鼠心肌肥厚基因（ANP、BNP）以及心肌纖維化基因(TGF-β1、ProcollagenⅠ、ProeollagenⅢ)表達(dá)。
　　 (6)使用G-Li

11、sa方法檢測RhoA蛋白表達(dá)水平，western-blot方法檢測P38 MAPK的活性。
　　 結(jié)果:
　　 (1) AngⅡ誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚和纖維化。
　　 (2)抑制FPPS改善AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚和纖維化。
　　 (3)AngⅡ增加FPPS的表達(dá)，抑制FPPS減少AngⅡ小鼠中磷酸化P-38的表達(dá)。
　　 (4)抑制FPPS降低AngⅡ誘導(dǎo)的ANP, BNP, TGF-β1，Proc

12、ollagenⅠ，ProcollagenⅢ mRNA及ANP, TGF-β1，collagenⅠ，collagenⅢ蛋白表達(dá)增加。
　　 (5)抑制FPPS降低AngⅡ誘導(dǎo)的FPP和GGPP水平增加。
　　 (6)抑制FPPS減少AngⅡ誘導(dǎo)的RhoA活性增加。
　　 結(jié)論:
　　 FPPS在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚和纖維化過程中具有重要的作用，至少部分是通過抑制RhoA的活化，減少p38的磷酸化和下調(diào)TG