抗菌肽HEDISTIN和二氫葉酸還原酶突變體DHFR-W21H的結構及生物作用機制研究.pdf

1、在后基因組時代,基因的表達產物及基因功能的實施者—蛋白質的結構與功能成為一個新的研究熱點。核磁共振(NMR)是一種很好的研究多肽和蛋白質空間結構,進而研究其結構與功能關系的研究工具。在本論文中,我們主要利用液體核磁共振技術對抗菌肽HEDISTIN和二氫葉酸還原酶突變體DHFR-W21H的溶液結構及其生物功能的作用機制進行了詳細的研究。論文分為以下兩個部分:
　　 一、抗菌肽HEDISTIN在溶液中的構象及其抗菌機理研究
　

2、　 隨著抗生素的廣泛使用,耐藥菌株和多重耐藥菌株不斷增加,病原菌的抗藥性問題日益嚴重,迫使人們加緊尋找傳統抗生素的替代品?？咕氖窃谏矬w中廣泛存在的一類具有生物活性的小分子多肽,這類活性多肽具有抗菌活性高、種類比較多、抗菌譜廣、特別是靶菌株不易產生耐藥性的特點,具備了開發(fā)成新型抗菌藥物的巨大潛力。2007年從沙蠶體腔內分離得到一種新型抗菌肽HEDISTIN,它是首個從海生環(huán)節(jié)動物中發(fā)現的被溴化的抗菌肽。它對革蘭氏陽性菌及耐甲氧西林金

3、黃色葡萄球菌(methicilin-resistant S.aureus)等表現出很好的抗菌性。但是,在抗菌作用機制尚不清楚的條件下,很難進一步開發(fā)。為了探究抗菌肽HEDISTIN的抗菌機理,我們首先應用NMR與圓二色譜(CD)技術解析了HEDISTIN在磷酸鹽緩沖液和在DPC(dodecylphosphocholine)微團環(huán)境中的三維結構。結果表明,抗菌肽HEDISTIN在磷酸鹽環(huán)境中沒有穩(wěn)定的有序構象,但在DPC微團環(huán)境下形成了獨

4、特的helix-turn-helix構象。這種helix-turn-helix構象與大多數陽離子小型多肽所具有的簡單的線型螺旋構象不同,由于中間的轉角而呈現出非均一性,但仍具有顯著的兩親性特征。以此結構為基礎,我們進一步采用分子動力學方法模擬了HEDISTIN作用于細胞膜的模擬膜—POPC脂雙層膜的相互作用過程。模擬數據顯示,該抗菌肽結構上的非均一性直接影響肽與膜作用的早期行為:第一段螺旋區(qū)(殘基Leu5-Lys8)或第二段螺旋區(qū)(殘基

5、Val13-Ala17),通過極性作用力,最先與膜的磷脂頭部區(qū)域接觸,并滲透入膜的疏水性區(qū)域,中間的轉角(殘基Val9-Thr12),作為極性微弱的區(qū)域,則是作為最后一部分接觸并進入膜中。這一現象提示,微團環(huán)境中的兩親性非均一構象相當接近當該肽遭遇菌細胞膜時的天然構象,以這種構象作用于細胞膜,提高了攻擊效率。更為重要的模擬數據顯示,隨著抗菌肽濃度在膜表面某些局部區(qū)域的升高,肽的分子之間發(fā)生聚集,當肽和脂的比例達到或超過5/128時,聚集

6、在一起的肽協同對膜造成較為強烈的擾動,以至于在膜中形成水分子通道。可以推測,這種水通道的形成會使細胞由于水的進入而最終脹裂破碎,抗菌肽HEDISTIN以此達到殺菌的目的。
　　 二、二氫葉酸還原酶突變體DHFR-W2lH的結構和作用機制研究
　　 二氫葉酸還原酶(DHFR)是生物體內廣泛存在的葉酸代謝關鍵酶,它在輔酶NADPH的作用下將二氫葉酸還原為四氫葉酸,對生物體內細胞的代謝起到重要作用。在已報道的DHFR序列中,T

7、rp21是極其保守的氨基酸殘基之一,它在空間位置上既靠近輔酶NADPH又靠近底物。對這一殘基的作用在全酶功能中的透徹了解將促進有效抑制劑的進一步開發(fā)。為了探究該殘基側鏈的大小對于全酶功能的影響,我們的前期研究將Trp21殘基突變?yōu)樾再|相似但是側鏈更小的His殘基,酶動力學測試發(fā)現,突變導致酶DHFR-W21H的催化常數Kcat隨pH的變化與野生型DHFR相比明顯不同,在pH＜6.0時,DHFR-W21H與野生型DHFR都保持著酶催化活性

8、,而在接近pH7.0時,DHFR-W21H卻幾乎完全喪失催化活性,而這時野生型DHFR仍然具有較強的酶催化活性。我們猜測導致這一結果的原因可能是由于突變?yōu)檩^小殘基后構象發(fā)生改變,所以我們使用核磁共振技術對突變體DHFR-W21H-MTX復合物在兩個不同pH值(pH5.8和7.5)下的蛋白質溶液結構進行了研究。結果表明:(1)DHFR-W21H在pH5.8和pH7.5條件下都類似于野生型.DHFR的結構,即主要由8個β-折疊,4個α-螺旋

9、,和兩段長的loop,即A-B loop(殘基9-23)和F-G loop(殘基119L-135)形成相似的拓樸結構。(2)位于A-B loop上的殘基Pro20-Lcu23片段在溶液中存在著構象交換,具有兩種較穩(wěn)定的可觀測構象,并且,殘基Pro20-Leu23片段的動力學行為在pH5.8和p87.5的DHFR-W21H-MTX復合物中不相同。(3)突變導致了空間上靠近Trp21殘基的局部區(qū)域受到了擾動,使A-B loop和F-G lo