抗菌肽HEDISTIN和二氫葉酸還原酶突變體DHFR-W21H的結(jié)構(gòu)及生物作用機(jī)制研究.pdf

1、在后基因組時(shí)代,基因的表達(dá)產(chǎn)物及基因功能的實(shí)施者—蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。核磁共振(NMR)是一種很好的研究多肽和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu),進(jìn)而研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究工具。在本論文中,我們主要利用液體核磁共振技術(shù)對(duì)抗菌肽HEDISTIN和二氫葉酸還原酶突變體DHFR-W21H的溶液結(jié)構(gòu)及其生物功能的作用機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的研究。論文分為以下兩個(gè)部分:
　　 一、抗菌肽HEDISTIN在溶液中的構(gòu)象及其抗菌機(jī)理研究
　

2、　 隨著抗生素的廣泛使用,耐藥菌株和多重耐藥菌株不斷增加,病原菌的抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重,迫使人們加緊尋找傳統(tǒng)抗生素的替代品?？咕氖窃谏矬w中廣泛存在的一類具有生物活性的小分子多肽,這類活性多肽具有抗菌活性高、種類比較多、抗菌譜廣、特別是靶菌株不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn),具備了開發(fā)成新型抗菌藥物的巨大潛力。2007年從沙蠶體腔內(nèi)分離得到一種新型抗菌肽HEDISTIN,它是首個(gè)從海生環(huán)節(jié)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的被溴化的抗菌肽。它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及耐甲氧西林金

3、黃色葡萄球菌(methicilin-resistant S.aureus)等表現(xiàn)出很好的抗菌性。但是,在抗菌作用機(jī)制尚不清楚的條件下,很難進(jìn)一步開發(fā)。為了探究抗菌肽HEDISTIN的抗菌機(jī)理,我們首先應(yīng)用NMR與圓二色譜(CD)技術(shù)解析了HEDISTIN在磷酸鹽緩沖液和在DPC(dodecylphosphocholine)微團(tuán)環(huán)境中的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,抗菌肽HEDISTIN在磷酸鹽環(huán)境中沒有穩(wěn)定的有序構(gòu)象,但在DPC微團(tuán)環(huán)境下形成了獨(dú)

4、特的helix-turn-helix構(gòu)象。這種helix-turn-helix構(gòu)象與大多數(shù)陽(yáng)離子小型多肽所具有的簡(jiǎn)單的線型螺旋構(gòu)象不同,由于中間的轉(zhuǎn)角而呈現(xiàn)出非均一性,但仍具有顯著的兩親性特征。以此結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),我們進(jìn)一步采用分子動(dòng)力學(xué)方法模擬了HEDISTIN作用于細(xì)胞膜的模擬膜—POPC脂雙層膜的相互作用過(guò)程。模擬數(shù)據(jù)顯示,該抗菌肽結(jié)構(gòu)上的非均一性直接影響肽與膜作用的早期行為:第一段螺旋區(qū)(殘基Leu5-Lys8)或第二段螺旋區(qū)(殘基

5、Val13-Ala17),通過(guò)極性作用力,最先與膜的磷脂頭部區(qū)域接觸,并滲透入膜的疏水性區(qū)域,中間的轉(zhuǎn)角(殘基Val9-Thr12),作為極性微弱的區(qū)域,則是作為最后一部分接觸并進(jìn)入膜中。這一現(xiàn)象提示,微團(tuán)環(huán)境中的兩親性非均一構(gòu)象相當(dāng)接近當(dāng)該肽遭遇菌細(xì)胞膜時(shí)的天然構(gòu)象,以這種構(gòu)象作用于細(xì)胞膜,提高了攻擊效率。更為重要的模擬數(shù)據(jù)顯示,隨著抗菌肽濃度在膜表面某些局部區(qū)域的升高,肽的分子之間發(fā)生聚集,當(dāng)肽和脂的比例達(dá)到或超過(guò)5/128時(shí),聚集

6、在一起的肽協(xié)同對(duì)膜造成較為強(qiáng)烈的擾動(dòng),以至于在膜中形成水分子通道?？梢酝茰y(cè),這種水通道的形成會(huì)使細(xì)胞由于水的進(jìn)入而最終脹裂破碎,抗菌肽HEDISTIN以此達(dá)到殺菌的目的。
　　 二、二氫葉酸還原酶突變體DHFR-W2lH的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制研究
　　 二氫葉酸還原酶(DHFR)是生物體內(nèi)廣泛存在的葉酸代謝關(guān)鍵酶,它在輔酶NADPH的作用下將二氫葉酸還原為四氫葉酸,對(duì)生物體內(nèi)細(xì)胞的代謝起到重要作用。在已報(bào)道的DHFR序列中,T

7、rp21是極其保守的氨基酸殘基之一,它在空間位置上既靠近輔酶NADPH又靠近底物。對(duì)這一殘基的作用在全酶功能中的透徹了解將促進(jìn)有效抑制劑的進(jìn)一步開發(fā)。為了探究該殘基側(cè)鏈的大小對(duì)于全酶功能的影響,我們的前期研究將Trp21殘基突變?yōu)樾再|(zhì)相似但是側(cè)鏈更小的His殘基,酶動(dòng)力學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn),突變導(dǎo)致酶DHFR-W21H的催化常數(shù)Kcat隨pH的變化與野生型DHFR相比明顯不同,在pH＜6.0時(shí),DHFR-W21H與野生型DHFR都保持著酶催化活性

8、,而在接近pH7.0時(shí),DHFR-W21H卻幾乎完全喪失催化活性,而這時(shí)野生型DHFR仍然具有較強(qiáng)的酶催化活性。我們猜測(cè)導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是由于突變?yōu)檩^小殘基后構(gòu)象發(fā)生改變,所以我們使用核磁共振技術(shù)對(duì)突變體DHFR-W21H-MTX復(fù)合物在兩個(gè)不同pH值(pH5.8和7.5)下的蛋白質(zhì)溶液結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:(1)DHFR-W21H在pH5.8和pH7.5條件下都類似于野生型.DHFR的結(jié)構(gòu),即主要由8個(gè)β-折疊,4個(gè)α-螺旋

9、,和兩段長(zhǎng)的loop,即A-B loop(殘基9-23)和F-G loop(殘基119L-135)形成相似的拓樸結(jié)構(gòu)。(2)位于A-B loop上的殘基Pro20-Lcu23片段在溶液中存在著構(gòu)象交換,具有兩種較穩(wěn)定的可觀測(cè)構(gòu)象,并且,殘基Pro20-Leu23片段的動(dòng)力學(xué)行為在pH5.8和p87.5的DHFR-W21H-MTX復(fù)合物中不相同。(3)突變導(dǎo)致了空間上靠近Trp21殘基的局部區(qū)域受到了擾動(dòng),使A-B loop和F-G lo