GSK-3β在高糖環(huán)境下足細胞轉分化效應中的作用.pdf

1、背景：
　　 糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是導致終末期腎臟病(end-stagerenaldisease，ESRD)的重要原因。蛋白尿是DN最常見的臨床表現(xiàn)，也是糖尿病腎病進展的獨立危險因素，因此減少蛋白尿是糖尿病腎病治療的重要舉措。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，其結構和功能的改變在DN蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了關鍵的作用。足細胞參與蛋白尿形成的原

2、因很多，機制復雜。作為一種終末分化的臟層上皮細胞，足細胞在某些刺激物的作用下可通過特定程序向間充質細胞轉化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，但足細胞在高糖環(huán)境下是否發(fā)生上皮-間充質轉分化以及足細胞的間充質轉分化是否參與蛋白尿的形成尚不清楚。
　　 目前研究認為，有三條信號通路介導了足細胞的轉分化過程，即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin，而廣泛存

3、在于真核生物體內的糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β，GSK-3β)是以上三條通路的參與者，但其是否參與高糖環(huán)境下足細胞的轉分化目前尚不明確。
　　 無機離子鋰（本課題使用氯化鋰）是一種治療狂躁和抑郁癥的藥物，是GSK-3β的選擇性活性抑制劑，通過鋰的作用，抑制高糖環(huán)境下GSK-3β的活性，并觀察足細胞表型和功能的變化，或許能為糖尿病腎病蛋白尿尋找新的治療靶點。
　　 目的：
　　

4、 本實驗通過觀察高糖環(huán)境下小鼠足細胞表型和功能的改變、GSK-3β表達量和活性的改變、以及抑制GSK-3β活性和表達量后足細胞表型和功能的變化，來研究GSK-3β在高糖環(huán)境下足細胞轉分化效應中的作用，并為糖尿病腎病蛋白尿的治療尋找新的靶點。
　　 方法：
　　 以條件永生化小鼠足細胞為研究對象。
　　 1.高糖環(huán)境下檢測足細胞表型和功能:
　　 (1)不同濃度葡萄糖對足細胞表型的影響:用含不同濃度葡萄糖

5、(12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理足細胞36h，并設正常對照組(5.6mmol/L葡萄糖)和高滲對照組（5.6mmol/L葡萄糖+44.4mmol/L甘露醇），采用Western-blot與間接免疫熒光的方法檢測足細胞表面標記蛋白nephrin，podocin和間充質細胞表型標志物α-SMA，F(xiàn)ibronectin的表達;
　　 (2)不同濃度葡萄糖刺激足細胞36h后白蛋白流入量的變化:將分化成熟的足細胞以

6、一定密度(5×103)接種于transwell小室上層的聚酯纖維膜上，待細胞融合后，換無血清培養(yǎng)基饑餓8小時，然后使用含不同濃度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理足細胞36小時，36h后使用滅菌PBS洗滌細胞兩次，然后給Transwell濾過膜的上部換上0.3ml的RPMI1640培養(yǎng)基，下部充滿1ml含40mg/ml胎牛血清白蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃孵育1小時后，取上層培養(yǎng)液，用BCA

7、蛋白濃度測定試劑盒測定濾過膜上部培養(yǎng)基的白蛋白濃度，即白蛋白流入量。
　　 2.高糖環(huán)境下足細胞GSK-3β表達量及活性的變化:
　　 (1)不同濃度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/LGlu)處理足細胞36h后，用Western-blot檢測GSK-3β及其9位絲氨酸位點pSer9GSK-3β（抑制位點）的表達量以及216位酪氨酸位點pTyr216GSK-3β（活化位點）的表達量;
　　 (2)不同

8、糖濃度處理的足細胞GSK-3β活性的變化:足細胞按上述濃度分組培養(yǎng)36h后，按照GSK-3β活性檢測試劑盒（GenmedScientific，美國）說明書處理足細胞，依次加入各種試劑，于分光光度計上檢測各組樣品的OD值，按試劑盒說明書給出的公式計算GSK-3β的活性。
　　 3.應用siRNA干擾GSK-3β后檢測足細胞表型及功能:
　　 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的小鼠的GSK-3β全長基因(GeneBankNO.

9、NM-019827.6)由上海吉凱基因化學技術有限公司設計的靶序列mRNA(5'-3')為:CCACTCAAGAACTGTCAAGTA.，陰性對照的siRNA正義鏈(5'-3')序列為:UUCUCCGAACGUGUCACGUtt。應用轉染試劑LipofectamineTM2000（invitrogen，美國）將GSK-3βsiRNA以30nmol的濃度轉染足細胞36小時后檢測各組足細胞nephrin，podocin，α-SMA表達量的變

10、化;同時應用Transwell檢測各組的白蛋白流入量以評估足細胞的單層屏障功能。
　　 4.應用GSK-3β活性抑制劑后足細胞表型及功能的變化
　　 應用LiCl，一種經(jīng)典的GSK-3β活性抑制劑，觀察抑制GSK-3β活性后足細胞表型及功能的變化，或許能為糖尿病腎病蛋白尿的臨床治療提供借鑒。將實驗分為正常糖對照組(5.6mmol/LGlu)，正常糖+LiCl組，高糖組(25mmol/LGlu)、高糖+LiCl組，檢測各組

11、足細胞標記蛋白nephrin，podocin，間充質標記蛋白α-SMA，F(xiàn)ibronectin的表達量，并應用Transwell檢測各組足細胞的白蛋白流入量，觀察單層屏障功能的變化。
　　 結果：
　　 1.(1)Western-blot與間接免疫熒光結果均顯示:與高糖組相比，正常糖對照組和高滲對照組足細胞高表達nephrin，podocin，僅少量表達間充質蛋白標記物α-SMA，F(xiàn)ibronectin;對Western

12、-blot結果進行灰度分析，發(fā)現(xiàn)nephrin，podocin的蛋白表達水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性下調(P＜0.05)，α-SMA的表達水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性上調(P＜0.05);(2)用Transwell測不同處理的足細胞白蛋白流入量，評估足細胞的單層屏障功能，發(fā)現(xiàn)與正常糖濃度組相比，高糖組白蛋白流入量增加，且隨葡萄糖濃度的升高呈計量依賴性上調(P＜0.05)。
　　 2.(1)Western-blot結果

13、顯示，與正常糖及高滲對照組相比，高糖組足細胞GSK-3β表達量增多，pSer9GSK-3β表達量減少，pTyr216GSK-3β表達量增多，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);(2)GSK-3β激酶活性檢測試劑盒顯示，與正常糖相比，經(jīng)高糖處理的足細胞GSK-3β活性增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.應用GSK-3βsiRNA處理足細胞發(fā)現(xiàn)，應用GSK-3βsiRNA處理組與陰性對照組及高糖對照組相比，足細胞表

14、面標記蛋白nephrin，podocin表達量增多，間充質標記蛋白α-SMA表達減少;用Transwell檢測各組白蛋白流入量，發(fā)現(xiàn)處理組白蛋白流入量減少，單層屏障功能改善。
　　 4.高糖環(huán)境下，應用GSK-3β活性抑制劑LiCl可以部分逆轉足細胞的轉分化，改善足細胞的單層屏障功能。
　　 結論：
　　 1.足細胞在高糖環(huán)境下發(fā)生轉分化（表型改變與功能受損）。
　　 2.GSK-3β參與高糖環(huán)境下足細胞