microRNA-15a在高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、背景：
　　腹膜纖維化（peritoneal fibrosis,PF）導(dǎo)致超濾衰竭（ultrafiltration failure,UFF）是目前腹膜透析（peritoneal dialysis,PD）患者終止腹膜透析的主要原因。已經(jīng)證實(shí)，長(zhǎng)期PD導(dǎo)致的腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管形成及間皮下層增厚是發(fā)生腹膜纖維化的重要病理生理基礎(chǔ)，其中以新生血管形成和間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化最為重要。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascu

2、lar endothelial growth factor,VEGF）是一種能選擇性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的蛋白質(zhì)。既往研究證實(shí)VEGF與腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、血管新生的關(guān)系密切。轉(zhuǎn)分化的腹膜間皮細(xì)胞侵入及遷徙到間皮下層的能力增加，并產(chǎn)生更多的VEGF；腹膜透析超濾衰竭患者腹膜間皮細(xì)胞VEGF的生成明顯增多；誘導(dǎo)腹膜透析患者腹膜間皮細(xì)胞VEGF表達(dá)能促進(jìn)腹膜新生血管增多，出現(xiàn)超濾衰竭。因此，VEGF的表達(dá)上調(diào)是腹膜纖維化及腹膜超濾衰竭發(fā)生的

3、關(guān)鍵因素，但其分子機(jī)制尚未明確。
　　微小RNA（MicroRNAs,miRNA,miR）是一類(lèi)非編碼小分子RNA，存在于真核生物，長(zhǎng)度約20-22個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控目的基因的表達(dá)。microRNAs通過(guò)與靶信使RNA（messenger RNA,mRNA）的3’端非編碼區(qū)（untranslated region,UTR）的堿基完全或者不完全配對(duì)結(jié)合，從而直接降解靶mRNA，或者抑制靶mRNA的翻譯，起到下調(diào)靶蛋白表達(dá)的目

4、的。microRNAs在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和腫瘤的發(fā)生中起重要作用。本課題前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-15a在高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中表達(dá)下調(diào)，與VEGF表達(dá)存在負(fù)相關(guān)。利用生物信息學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)VEGF可能是miR-15a的靶基因。因此我們提出假設(shè)，miR-15a通過(guò)作用于VEGF參與高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程，從而參與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察高糖刺激人腹膜間皮細(xì)胞（huma

5、n peritoneal mesothelial cells,HPMCs）轉(zhuǎn)分化模型中miR-15a、VEGF及反應(yīng)纖維化的指標(biāo)E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的表達(dá)變化，以及改變miR-15a的表達(dá)后VEGF及纖維化指標(biāo)E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的表達(dá)變化，探討miR-15a是否參與高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程，并驗(yàn)證miR-15a是否通過(guò)VEGF參與此過(guò)程。

6、r>　　方法：
　　以條件永生化人腹膜間皮細(xì)胞為研究對(duì)象
　　1．觀察高糖環(huán)境下人腹膜間皮細(xì)胞miR-15a、VEGF及纖維化指標(biāo)E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的表達(dá)變化。體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞分為以下四組：正常對(duì)照組（17.5mmol/LD-葡萄糖）、75mmo/LD-葡萄糖組、125mmo/LD-葡萄糖組、高滲對(duì)照組（17.5mmol/LD-葡萄糖+107.5mmol/LD-甘露醇），培

7、養(yǎng)48小時(shí)后光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，提取細(xì)胞總蛋白和總RNA進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。western blot檢測(cè)VEGF、E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的蛋白表達(dá)水平，qRT-PCR檢測(cè)miR-15a、VEGF mRNA表達(dá)水平。
　　2．雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證VEGF是否是miR-15a的靶基因。構(gòu)建野生型和突變型VEGF3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別與miR-15a mimics共轉(zhuǎn)染人腹膜

8、間皮細(xì)胞，設(shè)立相應(yīng)轉(zhuǎn)染對(duì)照組，轉(zhuǎn)染36小時(shí)裂解細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證VEGF與miR-15a的靶向關(guān)系。
　　3．探討正常條件下改變miR-15a表達(dá)水平后，VEGF及纖維化指標(biāo)E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的表達(dá)變化。正常糖濃度條件下培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞并分為以下四組：正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染miR-15a mimics組（濃度75nM）、轉(zhuǎn)染miR-15a inhib

9、itor組（濃度100nM）、轉(zhuǎn)染對(duì)照組（濃度100nM），培養(yǎng)48小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白和總RNA進(jìn)行檢測(cè)。western blot檢測(cè)VEGF、E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的蛋白表達(dá)水平，qRT-PCR檢測(cè)miR-15a，VEGF mRNA表達(dá)水平。
　　4．探討高糖環(huán)境下上調(diào) miR-15a的表達(dá)水平后， VEGF及纖維化指標(biāo)E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的表達(dá)

10、變化。體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞分為以下四組：正常對(duì)照組、單純高糖組（含125mmo/LD-葡萄糖）、高糖轉(zhuǎn)染miR-15a mimics組（125mmo/LD-葡萄糖+75nM miR-15a mimics）、高糖轉(zhuǎn)染對(duì)照組（125mmo/LD-葡萄糖+100nM miR-control），培養(yǎng)48小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白和總RNA進(jìn)行檢測(cè)。western blot檢測(cè) VEGF、E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、F

11、N的蛋白表達(dá)水平，qRT-PCR檢測(cè)miR-15a，VEGF mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1.高糖環(huán)境對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)、miR-15a、VEGF及纖維化指標(biāo)E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN表達(dá)水平的影響
　　與正常對(duì)照組相比，高糖環(huán)境使人腹膜間皮細(xì)胞從鋪路石樣向長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變，以125mmo/LD-葡萄糖組更明顯，而滲透壓對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。與正常對(duì)照組相比，高糖環(huán)境使miR-

12、15a表達(dá)下調(diào)，VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平下調(diào)，MMP9、α-SMA、Col-IV、FN蛋白表達(dá)均增多，呈濃度依賴(lài)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.VEGF是miR-15a的靶基因
　　雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染 miR-15a mimics和突變型VEGF3’UTR組相比，當(dāng)HPMCs共轉(zhuǎn)染miR-15a mimics和野生型VEGF3’UTR時(shí)所

13、檢測(cè)到的熒光素酶活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.正常糖濃度條件下改變miR-15a表達(dá)水平后， VEGF及纖維化指標(biāo)E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的表達(dá)變化
　　與正常對(duì)照組相比，miR-15a mimics顯著上調(diào)miR-15a表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），miR-15a inhibitor轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組miR-15a表達(dá)水平無(wú)明顯變化。與正常對(duì)照

14、組相比，miR-15a mimics轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)增多，MMP9、α-SMA、Col-IV、FN蛋白表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與正常對(duì)照組相比，miR-15a inhibitor轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)減少，MMP9、α-SMA、Col-IV、FN蛋白表達(dá)均增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4

15、.高糖環(huán)境下增加miR-15a的表達(dá)后，VEGF及纖維化指標(biāo)E-cadherin、MMP9、α-SMA、Col-IV、FN的表達(dá)變化
　　與正常對(duì)照組相比，高糖組miR-15a表達(dá)下調(diào)，VEGF蛋白和mRNA表達(dá)均上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平下調(diào)，MMP9、α-SMA、Col-IV、FN蛋白表達(dá)均增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與單純高糖組相比，高糖轉(zhuǎn)染miR-15a mimics組miR-15a表達(dá)上調(diào)，VE

16、GF蛋白和mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)增多，MMP9、α-SMA、Col-IV、FN蛋白表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．高糖能刺激人腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，使miR-15a表達(dá)水平下調(diào)；高糖使VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平上調(diào)，與miR-15a的變化呈負(fù)相關(guān)。
　　2．VEGF mRNA是miR-15a的靶基因。
　　3．過(guò)表達(dá)miR-15a抑制人腹膜間