GSK-3β對(duì)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及糖尿病腎病蛋白尿的影響.pdf

1、背景和目的：
　　糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者最主要的并發(fā)癥之一，也是終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的最主要病因。傳統(tǒng)的血糖控制及現(xiàn)有的藥物治療可以減慢卻并不能阻止DN的進(jìn)展。蛋白尿（尤其是微量白蛋白尿）是糖尿病腎損害的最早期表現(xiàn)之一，尿蛋白排泄率與進(jìn)展至終末期腎臟病的幾率和速度正相關(guān)?，F(xiàn)已證實(shí)，DN是一種足細(xì)胞病，足細(xì)胞脫落、凋亡是糖尿病腎病足

2、細(xì)胞損傷的途徑之一，與蛋白尿的出現(xiàn)密切相關(guān)。但人們也觀察到在OVE26轉(zhuǎn)基因小鼠（1型糖尿病模型）出現(xiàn)微量蛋白尿之后，足細(xì)胞數(shù)量和密度才開始減少，提示足細(xì)胞脫落、凋亡并非DN蛋白尿的首發(fā)表現(xiàn)。
　　上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的另一條可能途徑，表現(xiàn)在P-cadherin，ZO-1、nephrin等上皮細(xì)胞樣表型標(biāo)志物丟失，F(xiàn)spI、desm

3、in、collagenI、fibronectin等間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)。高糖刺激可能導(dǎo)致足細(xì)胞EMT，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂，脫離基底膜，進(jìn)一步促進(jìn)了糖尿病腎病發(fā)展。
　　TGF-β/smad、Wnt/β-catenin和integrin/ILK通路是調(diào)控足細(xì)胞EMT的主要信號(hào)通路，糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)參與了以上通路，可能也參與了高糖刺激所致的足細(xì)胞EM

4、T過程。GSK-3β還可通過調(diào)控糖原的合成維持血糖的平穩(wěn)，可能在DN蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前GSK-3β的抑制劑已被用于包括系膜增生性腎小球腎炎、新月體性腎小球腎炎、增殖性狼瘡性腎炎在內(nèi)的多種腎小球疾病的實(shí)驗(yàn)性治療。同時(shí)也有研究顯示，GSK-3β抑制劑LiC1和2Z，3E-6-溴靛-3-肟[(2'Z，3'E)-6-bromoindirubin-3'-oxime，BIO]能顯著抑制高糖刺激所致的系膜細(xì)胞凋亡。
　　本研

5、究實(shí)驗(yàn)，旨在通過觀察高糖刺激以及調(diào)控GSK-3β的表達(dá)對(duì)足細(xì)胞EMT和糖尿病腎病蛋白尿的作用，探討GSK-3β抑制劑在足細(xì)胞EMT以及DN蛋白尿中可能發(fā)揮的作用及機(jī)制，為DN的早期干預(yù)治療尋找新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　研究共分兩個(gè)部分:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):GSK-3β對(duì)db/db糖尿病腎病小鼠腎小球損傷的影響
　　觀察DN的進(jìn)展對(duì)db/db小鼠腎皮質(zhì)組織中GSK-3β活性、表達(dá)量及EMT相關(guān)細(xì)胞表型標(biāo)記物表達(dá)量的影響;以及

6、應(yīng)用GSK-3β抑制劑BIO對(duì)db/db糖尿病腎病小鼠腎損傷進(jìn)展、上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和VDR表達(dá)的影響。.探討GSK-3β抑制劑在DN蛋白尿以及足細(xì)胞EMT中可能發(fā)揮的作用及機(jī)制。
　　體外實(shí)驗(yàn):高糖刺激下調(diào)控GSK-3β的表達(dá)對(duì)足細(xì)胞EMT的作用
　　觀察高糖刺激對(duì)小鼠足細(xì)胞表型及GSK-3β的表達(dá)量、活性的影響;以及調(diào)控GSK-3β的表達(dá)對(duì)高糖條件下足細(xì)胞EMT的影響。探討GSK-3β抑制劑在足細(xì)胞損傷，尤其足細(xì)胞EM

7、T中可能發(fā)揮的作用及機(jī)制，為DN的治療尋找新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　第一部分GSK-3β對(duì)db/db糖尿病腎病小鼠腎小球損傷的影響
　　一、材料與方法：
　　選取SPF級(jí)db/+m小鼠24只，設(shè)為正常對(duì)照組。db/db糖尿病腎病小鼠48只，隨機(jī)分為:非干預(yù)組和BIO干預(yù)組（320ug/kg，自12周齡起，每日一次，皮下注射）。每組分別于12周齡、15周齡（用藥3周）、18周齡（用藥6周）各處死8只。
　?、倭魷y血

8、糖、24h尿蛋白排泄率，稱體重、腎重;
　　②病理學(xué)檢查:腎組織行HE染色，光鏡下觀察腎組織改變，透射電鏡觀察足細(xì)胞足突等的變化;
　?、勖庖邿晒夥z測腎皮質(zhì)組織中nephrin、podocm、GSK-3β和pSer9-GSK-3β蛋白表達(dá)定位;
　?、芊蛛x腎臟皮質(zhì)組織提取總RNA和蛋白標(biāo)本，Western印跡法檢測nephrin、podocin、synaptopodin、fibronectin、α-SMA、GSK-3

9、β、pSer9-GSK-3β、pTyr216-GSK-3β、β-catenin、snail、VDR的蛋白表達(dá)水平;
　?、軷T-PCR檢測nephrin、α-SMA、GSK-3β和β-catenin在mRNA水平上的表達(dá);
　?、蘩肎SK-3β酶活性檢測試劑盒檢測GSK-3β的磷酸酶活性。
　　二、結(jié)果：
　　1.db/db小鼠的腎重明顯大于db/+m小鼠(P＜0.05)。與不給藥組db/db小鼠相比，BIO給

10、藥組db/db小鼠的腎重明顯減輕（P＜0.05）。
　　2.db/db小鼠有嚴(yán)重的蛋白尿，實(shí)驗(yàn)期間，其24h尿蛋白總量是db/+m小鼠組的7倍以上(P＜0.05)。BIO給藥6周后db/db小鼠的蛋白尿較未用藥組db/db小鼠組下降了一半以上(P＜0.05)。
　　3.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，db/db小鼠始終有嚴(yán)重的高糖血癥，血糖一般高于30mmol/L。BIO給藥組與不給藥組db/db小鼠的血糖水平差異無顯著性差異（P＞0.05

11、）。
　　4.隨糖尿病腎病病程的延長，DN組糖尿病腎病小鼠腎組織中上皮細(xì)胞表型標(biāo)記物nephrin、podocin、synaptopodin在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)較NC組呈時(shí)間依賴性下調(diào)(P＜0.05)。
　　5.隨糖尿病腎病病程的延長，DN組糖尿病腎病小鼠腎組織中間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記物fibronectin、α-SMA在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)較NC組呈時(shí)間依賴性上調(diào)(P＜0.05)。
　　6.隨糖尿病腎病病程

12、的延長，DN組糖尿病腎病小鼠腎組織中與轉(zhuǎn)分化相關(guān)的β-catenin和snail在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)較NC組呈時(shí)間依賴性上調(diào)（P＜0.05）
　　7.隨糖尿病腎病病程的延長，DN組糖尿病腎病小鼠腎組織中GSK-3β、pTyr216-GSK-3β在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)較DN組呈時(shí)間依賴性上調(diào)(P＜0.05);pSer9-GSK-3β在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)較NC組呈時(shí)間依賴性下調(diào)(P＜0.05)
　　8.應(yīng)用

13、GSK-3β抑制劑后，BIO組糖尿病腎病小鼠腎組織中上皮細(xì)胞表型標(biāo)記物nephrin、podocin、synaptopodin在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)下調(diào)較DN組有所緩解(P＜0.05)，但仍低于NC組(P＜0.05);
　　9.應(yīng)用GSK-3β抑制劑后，BIO組糖尿病腎病小鼠腎組織中間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記物fibronectin、α-SMA在mRNA和蛋白水平上表達(dá)上調(diào)較DN組有所緩解，但仍高于NC組(P＜0.05)。
　

14、　10.應(yīng)用GSK-3β抑制劑后，BIO組糖尿病腎病小鼠腎組織中轉(zhuǎn)分化相關(guān)的β-catenin和snail在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)上調(diào)較DN組有所緩解(P＜0.05)，但仍高于NC組(P＜0.05)。
　　11.隨著GSK-3β抑制劑用藥時(shí)間的延長，BIO組糖尿病腎病小鼠腎組織中GSK-3β、pTyr216-GSK-3β在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)呈時(shí)間依賴性下調(diào)（P＜0.05）;pSer9-GSK-3β在mRNA和蛋白水平上

15、的表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)(P＜0.05)。
　　12.隨糖尿病腎病病程的延長，DN組的db/db小鼠出現(xiàn)足突融合、消失，腎小球基底膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞脫落，系膜基質(zhì)增多，并伴有結(jié)節(jié)性腎小球硬化（Kimmelstiel-Wilson結(jié)節(jié)）。BIO干預(yù)后，顯著減輕了以上病理改變。
　　13.免疫熒光結(jié)果顯示:隨糖尿病腎病病程的延長，DN組糖尿病腎病小鼠腎組織中nephrin和podocin的表達(dá)較NC組呈時(shí)間依賴性下調(diào)，應(yīng)用BIO后，

16、nephrin和podocin的表達(dá)下調(diào)較DN組有所緩解，但仍低于NC組
　　14.免疫熒光結(jié)果顯示:隨糖尿病腎病病程的延長，DN組糖尿病腎病小鼠腎組織中GSK-3β的表達(dá)較NC組呈時(shí)間依賴性上調(diào)，pSer9-GSK-3β的表達(dá)呈時(shí)間依賴性下調(diào);應(yīng)用BIO后，GSK-3β的表達(dá)上調(diào)和pSer9-GSK-3β的表達(dá)下調(diào)較DN組有所緩解
　　15.利用GSK-3β酶活性檢測試劑盒檢測GSK-3β的磷酸酶活性，可以看到隨糖尿病腎病

17、的進(jìn)展，GSK-3β的活性逐漸增強(qiáng)，應(yīng)用BIO后，有效抑制了GSK-3β的活性。
　　16.隨糖尿病腎病病程的延長，DN組糖尿病腎病小鼠腎組織中VDR在蛋白水平上的表達(dá)較NC組呈時(shí)間依賴性下調(diào)（P＜0.05）。應(yīng)用GSK-3β抑制劑BIO后，糖尿病腎病小鼠腎組織中VDR在蛋白水平上的表達(dá)下調(diào)較DN組有所緩解(P＜0.05)，但仍低于NC組(P＜0.05)
　　第二部分高糖刺激下調(diào)控GSK-3β的表達(dá)對(duì)足細(xì)胞EMT的作用

18、>　　一、材料與方法：
　　以條件永生化小鼠足細(xì)胞(MPC-5)為研究對(duì)象，先置細(xì)胞于在33℃有干擾素-γ（許可條件下）的培養(yǎng)基中增殖;再換為37℃無干擾素-γ（非許可條件下）的環(huán)境下使細(xì)胞趨于分化成熟，并用含以下配比成分的1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞:
　?、僬Ｌ菨舛冉M:含5.6mmol/L葡萄糖;
　　②正常糖濃度+BIO組:含5.6mmol/L葡萄糖+10μmol/LBIO;
　?、鄹咛墙M:含25mmol/L葡

19、萄糖;
　?、芨咛?BIO組:含25mmol/L葡萄糖+10μmol/LBIO。
　　36h后采用WesternBlot的方法從蛋白水平檢測各組足細(xì)胞中nephrin、α-SMA、GSK-3β、pTyr216-GSK-3β、pSer9-GSK-3β、β-catenin和VDR的蛋白表達(dá)水平，通過白蛋白流入量實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)單層足細(xì)胞的濾過屏障功能。
　　二、結(jié)果：
　　1.高糖環(huán)境下，與正常糖濃度組相比，足細(xì)胞上皮表型

20、標(biāo)記物nephrin在蛋白水平上的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，間充質(zhì)表型標(biāo)記物α-SMA的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)。
　　2.正常糖濃度時(shí)，BIO對(duì)足細(xì)胞nephrin和α-SMA蛋白表達(dá)的影響甚微(P＞0.05)。高糖環(huán)境下，應(yīng)用BIO可緩解高糖刺激所致的nephrin表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)和α-SMA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。
　　3.高糖刺激可使足細(xì)胞GSK-3β、pTyr216-GSK-3β的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)

21、(P＜0.05)，pSer9-GSK-3β的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。
　　4.高糖環(huán)境下，應(yīng)用BIO可下調(diào)足細(xì)胞GSK-3β、pTyr216-GSK-3β在蛋白水平上的表達(dá)(P＜0.05)，上調(diào)pSer9-GSK-3β的表達(dá)(P＜0.05)。
　　5.高糖環(huán)境下，與正常糖濃度組相比，足細(xì)胞β-catenin的蛋白表達(dá)有所上調(diào)(P＜0.05)，應(yīng)用BIO可部分緩解高糖刺激所致的足細(xì)胞β-catenin表達(dá)上調(diào)(P＜0

22、.05)。
　　6.高糖刺激下調(diào)了足細(xì)胞VDR的表達(dá)，應(yīng)用BIO可部分緩解高糖刺激所致的足細(xì)胞VDR表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。
　　7.正常糖濃度時(shí)，BIO對(duì)足細(xì)胞β-catenin和VDR蛋白表達(dá)的影響甚微(P＞0.05)。
　　8.與正常糖濃度組相比，高糖濃度組接種單層足細(xì)胞的transwell中白蛋白流入量顯著升高(P＜0.05)，應(yīng)用BIO對(duì)正常糖濃度下的白蛋白流入量影響不大(P＞0.05)，但可減緩高糖刺激下

23、白蛋白流入量的升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.高糖刺激可致足細(xì)胞上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化;GSK-3β抑制劑可部分緩解高糖所致的足細(xì)胞上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生。
　　2.高糖刺激可上調(diào)足細(xì)胞和腎組織中GSK-3β的活性;BIO可下調(diào)其活性。
　　3.除經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路外，高糖環(huán)境下，GSK-3β可能還通過VDR等因子對(duì)足細(xì)胞EMT進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　4.高糖可致單層足細(xì)胞的濾過屏障