GSK-3在不同凋亡模型中作用的差異分析.pdf

1、由于神經(jīng)元凋亡而引起神經(jīng)元丟失是神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏病(Parkinson’s Disease，PD)和老年性癡呆癥(Alzheimer's Disease，AD)的主要病理特征。神經(jīng)元凋亡的發(fā)生取決于抗神經(jīng)元凋亡通路信號(hào)和促神經(jīng)元凋亡通路信號(hào)之間的平衡。闡明神經(jīng)元凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控機(jī)制，對(duì)揭示神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的本質(zhì)，尋找、確立藥物靶點(diǎn)，從而達(dá)到有效防治神經(jīng)退行性疾病的目的，具有重要的意義。 神經(jīng)元凋亡是由一系列基因

2、控制的主動(dòng)過(guò)程，轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin D及蛋白合成抑制劑cycloheximide可以有效地保護(hù)神經(jīng)元，說(shuō)明凋亡的發(fā)生需要新的RNA的轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的合成。從關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路入手，系統(tǒng)地尋找凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵分子，并探索其調(diào)控機(jī)制對(duì)于認(rèn)識(shí)凋亡發(fā)生的本質(zhì)，以及干預(yù)凋亡的發(fā)生具有重要意義。 體外培養(yǎng)的高純度(>95％)小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neuron，CGN)是神經(jīng)元凋亡及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

3、研究最經(jīng)典、最常用的細(xì)胞模型之一。體外原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元的存活有賴于"電活性"或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的"營(yíng)養(yǎng)"作用，如用高濃度KCl模擬體內(nèi)"電活性"。當(dāng)培養(yǎng)在高濃度KCl(25 mM KCL25 K)培養(yǎng)基的小腦顆粒神經(jīng)元分化成熟時(shí)，將培養(yǎng)基中的高濃度KCl換成低濃度KCl(5 mM KCl)(撤鉀處理)，小腦顆粒神經(jīng)元即發(fā)生典型的凋亡，有50％的神經(jīng)元在24小時(shí)內(nèi)發(fā)生凋亡。利用這一凋亡模型，一些關(guān)鍵的調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得以發(fā)現(xiàn)

4、和闡明，如PI3K/Akt、Akt/FKGRL1、cAMP/PKA/GSK-3 β和JNK/c-Jun通路。 谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞含量最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞，維持著神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。近年來(lái)的大量研究表明：持續(xù)性或短暫性、全腦或局部腦缺血，將導(dǎo)致興奮性氨基酸谷氨酸量的明顯增加，過(guò)量的谷氨酸激活突觸后膜的興奮性氨基酸受體，產(chǎn)生興奮性毒性作用，促進(jìn)NMDA通道的大量開(kāi)放，隨之而來(lái)的鈣超載是腦缺血后神經(jīng)元死

5、亡的主要的胞內(nèi)機(jī)制，進(jìn)而誘發(fā)各種神經(jīng)變性疾病。利用體外培養(yǎng)的神經(jīng)元建立離體的谷氨酸神經(jīng)毒性模型，以模擬在體腦缺血/腦中風(fēng)等病變已廣泛用于許多研究。在體外原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，谷氨酸的興奮毒性造成神經(jīng)元死亡的方式是凋亡還是壞死是有爭(zhēng)議的，但是近年的研究證明，在谷氨酸誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元的死亡中凋亡和壞死共存。在給予谷氨酸刺激的數(shù)小時(shí)里，有一部分敏感的神經(jīng)元很快出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、破裂而發(fā)生壞死，但是在早期的興奮性毒性刺激中存活下來(lái)的這一部分神經(jīng)元，則

6、會(huì)發(fā)生以核固縮、DNA降解等為特征的遲發(fā)性凋亡。因?yàn)榈蛲龅陌l(fā)生需要一定的時(shí)間，而且在適當(dāng)?shù)臈l件下可以逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元凋亡的情況，有挽救的可能性，所以研究可以抑制凋亡的化合物有更重要的臨床治療意義。在這一凋亡模型，一些關(guān)鍵的調(diào)控細(xì)胞凋亡的激酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和闡明，如PI3K/Akt、p38 MAPK等。 糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是一個(gè)多功能的絲氨酸/蘇氨酸類激酶，在真核生物中普遍

7、存在。GSK-3在剛發(fā)現(xiàn)的時(shí)候認(rèn)為僅參與肌肉能量?jī)?chǔ)存和新陳代謝。新近研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3能磷酸化多種底物，包括代謝與信號(hào)蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等，因而在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前為止，發(fā)現(xiàn)了多種GSK-3作用底物，其中包括糖原合成酶、轉(zhuǎn)錄起始因子eIF2、熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄因子(HSF-1)、c-Jun、c-Myc、c-myb、CREB等。GSK-3功能失調(diào)有可能導(dǎo)致心境障礙(Mood disorders

8、)、精神分裂癥(Schizophrenia)、老年性癡呆癥(Alzheimer disease，AD)、Ⅱ型糖尿病(Type Ⅱ diabetes)、癌癥等疾病。GSK-3調(diào)節(jié)這些不同的通路的精確機(jī)制及其上下游關(guān)系還不清楚，是目前研究的一大熱點(diǎn)。 研究目的： 1、比較GSK-3在兩種凋亡模型中的活性變化。 2、比較GSK-3在兩種凋亡模型中的作用。 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果： 1、撤鉀和谷氨酸處理誘導(dǎo)神經(jīng)元

9、凋亡 為驗(yàn)證本課題所使用兩種模型誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的方式是凋亡還是壞死，我們將體外培養(yǎng)7天的小腦顆粒神經(jīng)元，把培養(yǎng)條件換成無(wú)血清的含5 mmol/LKCl培養(yǎng)基或加入75gmol/L的glutamate時(shí)分別處理12、24小時(shí)后，進(jìn)行Hoechst33258核染色，在相差顯微鏡和倒置熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)?？梢?jiàn)25K和血清對(duì)照組神經(jīng)元胞體飽滿透亮，突起之間形成的網(wǎng)絡(luò)清晰而完整，核內(nèi)DNA分布相對(duì)均勻，呈現(xiàn)體積較大的淺染核形態(tài)；而

10、撤鉀和谷氨酸處理后神經(jīng)細(xì)胞皺縮、體積變小、形態(tài)改變，細(xì)胞膜完整，神經(jīng)元軸突和樹(shù)突斷裂、減少，核內(nèi)DNA濃聚，核出現(xiàn)不同程度的固縮，故呈現(xiàn)體積明顯縮小的深染核形態(tài)。 收集撤鉀和谷氨酸處理后的神經(jīng)元，提取DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，撤鉀和谷氨酸處理神經(jīng)元后可以觀察到典型的階梯狀DNA區(qū)帶圖譜(DNA ladder),顯示DNA有片段性斷裂，神經(jīng)元發(fā)生凋亡；25K和血清對(duì)照組的凝膠泳道上則看不到階梯狀DNA區(qū)帶圖譜，顯示DNA

11、完整無(wú)斷裂。 2、GSK-3在撤鉀誘導(dǎo)的CGNs凋亡時(shí)被激活 為檢測(cè)GSK-3的活性，我們將體外培養(yǎng)7天的小腦顆粒神經(jīng)元，分別用25 K或5 K培養(yǎng)基處理1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)。收集蛋白后用磷酸化特異的GSK-3抗體檢測(cè)GSK-3是否激活。觀察到撤鉀處理后GSK-3處于去磷酸化狀態(tài)，即處于激活狀態(tài)，同一張膜上檢測(cè)到不同處理組GSK-3的總蛋白量保持一致，說(shuō)明GSK-3磷酸化信號(hào)的變化不是蛋白上樣量的差異造成的。

12、 3、GSK-3在谷氨酸誘導(dǎo)的CGNs凋亡時(shí)不激活 為檢測(cè)GSK-3的活性，我們將體外培養(yǎng)7天的小腦顆粒神經(jīng)元，用谷氨酸處理10分鐘、30分鐘、1小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)。收集蛋白后用磷酸化特異的GSK-3抗體檢測(cè)GSK-3是否激活。觀察到谷氨酸處理后GSK-3處于磷酸化狀態(tài)，即處于失活狀態(tài)，同一張膜上檢測(cè)到不同處理組GSK-3的總蛋白量保持一致，說(shuō)明磷酸化信號(hào)的變化不是蛋白上樣量的差異造成的。為了驗(yàn)證谷氨酸模型的建立是成功的

13、，我們選用在谷氨酸模型中被磷酸化處于激活狀態(tài)的p38 MAPK作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)其磷酸化水平，結(jié)果顯示：p38在谷氨酸處理10min時(shí)磷酸化水平即升高，說(shuō)明谷氨酸模型是成功的。 4、抑制GSK-3的活性可以保護(hù)性干預(yù)撤鉀誘導(dǎo)的CGNs凋亡 為了研究GSK-3激活對(duì)撤鉀誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的必要性，我們將體外培養(yǎng)7天的小腦顆粒神經(jīng)元，使用GSK-3抑制劑AR-A014418、CT99021、SB415286處理后，Hoech

14、st33258染色顯示核形態(tài)，細(xì)胞核固縮或碎裂記為凋亡細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果顯示，GSK-3抑制劑SB415286、AR-A104418和CT99021處理組，可以將5 K的凋亡率從58％降到18％、22％和21％。以上結(jié)果表明，抑制GSK-3活性，可以保護(hù)性干預(yù)撤鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。 5、抑制GSK-3的活性對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的CGNs凋亡沒(méi)有保護(hù)作用 為了研究GSK-3激活對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的影

15、響，我們將體外培養(yǎng)7天的小腦顆粒神經(jīng)元，使用GSK-3抑制劑AR-A014418、CT99021、SB415286處理后，Hoechst33258染色顯示核形態(tài)，細(xì)胞核固縮或碎裂記為凋亡細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果顯示，在Glu時(shí)有51％的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡時(shí)的核固縮形態(tài)，而GSK-3抑制劑AR-A014418，CT99021和SB415286處理組，在Glu時(shí)凋亡率分別為54％、47％和52％，與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表

16、明，抑制GSK-3活性對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡沒(méi)有保護(hù)作用。 6、干擾質(zhì)粒有效特異抑制GSK-3表達(dá)，并保護(hù)性干預(yù)撤鉀誘導(dǎo)的CGNs凋亡 為證明GSK-3在神經(jīng)元凋亡中的作用，我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制GSK-3的表達(dá)，觀察GSK-3對(duì)低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的作用。運(yùn)用小分子干擾的設(shè)計(jì)軟件及其原則，設(shè)計(jì)干擾序列，通過(guò)BLAST，目的干擾序列與其他基因沒(méi)有顯著的同源性，并將合成的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸鏈克隆到

17、BS/U6載體；將shGSK-3同β-gal用鈣磷沉淀的方法共轉(zhuǎn)染小腦顆粒神經(jīng)元，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)對(duì)GSK-3表達(dá)的干擾有效性；將干擾質(zhì)粒同GFP質(zhì)粒用鈣磷沉淀的方法共轉(zhuǎn)染小腦顆粒神經(jīng)元，Hoechst 33258進(jìn)行核染色，統(tǒng)計(jì)干擾質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：測(cè)序表明成功構(gòu)建了shGSK-3質(zhì)粒；shGSK-3能夠有效干擾GSK-3的表達(dá)；干擾GSK-3可以保護(hù)性干預(yù)撤鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。以上結(jié)果表明：小分子干擾G