紅背葉根有效部位提取及體外抗乙肝病毒作用機制研究.pdf

1、紅背葉根作為嶺南地區(qū)常用的中草藥之一,主要用于治療與肝臟相關(guān)的疾患。以紅背葉根提取物為原料的固體口服制劑具有抗肝炎病毒和阻止肝纖維化的作用,但目前尚未見關(guān)于其化學(xué)成分、藥理作用方面的文獻報道,轉(zhuǎn)基因HepG2.2.15細胞株載有HBV全基因組,能夠進行病毒復(fù)制并穩(wěn)定分泌感染性病毒顆粒及HBsAg和HBeAg,因此被廣泛用于抗病毒藥物的篩選和療效評價。
　　 我們以 HepG2.2.15細胞作為靶細胞,采用 MTT比色法觀察紅背葉

2、根水提物,醇提物,生物堿含藥血清對 HepG2.2.15細胞的毒性作用；并分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法測定細胞培養(yǎng)上清中 HBsAg,HBeAg的含量,以此評價紅背葉根提取物體外抗HBV的作用。現(xiàn)先報告如下:
　　 實驗一:HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)體系的建立
　　 目的：使HepG2.2.15細胞正常生長,為紅背葉根水提物,醇提物,生物堿含藥血清干預(yù)實驗做準備。
　　 方法：分為細胞復(fù)蘇、細胞

3、培養(yǎng)、細胞傳代、細胞凍存四個步驟。
　　 結(jié)果：細胞復(fù)蘇后三周內(nèi)生長速度較緩慢,但傳代后生長狀態(tài)良好,可用于藥物干預(yù)實驗。
　　 實驗二:細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg分泌曲線的繪制
　　 目的：觀察 HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的分泌情況。
　　 方法：HepG2.2.15細胞經(jīng)傳代培養(yǎng),在其貼壁后1～6d分別收集細胞培養(yǎng)上清液,-20℃保存,統(tǒng)一檢測。使用ELIS

4、A法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg和HBeAg,顯色反應(yīng)后,酶標(biāo)儀讀取 A450nm值,繪制分泌曲線。
　　 結(jié)果： HepG2.2.15細胞在貼壁后1～6d,其培養(yǎng)上清液中的HBsAg和HBeAg通過酶標(biāo)儀所測的 A450nm值逐漸增大,分泌曲線呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。
　　 實驗三:紅背葉根各種提取物制備及含藥血清制備
　　 目的：制備紅背葉根各種提取物及其含藥血清。
　　 方法：
　　 1.紅背

5、葉根各種提取物制備
　　 紅背葉根各種提取物制備:紅背葉根采自廣東惠州,經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定與藥用植物教研室鑒定為大戟科植物紅背山麻桿 Alchornea trewioides(Benth.)Muell.-Arg.的根。100％紅背葉根制劑,取紅背葉根原藥材加8倍水,加熱回流2h,殘渣再加8倍水加熱回流2h,合并提取液后過濾,濃縮成體積與原藥材質(zhì)量比為1/1的流浸膏。按藥效學(xué)原則制成水溶液含生藥量10.4g/kg,冷藏備用。<

6、br>　　 紅背葉根醇提物制備:100％紅背葉根制劑,取紅背葉根原藥材加8倍量95％乙醇,用加熱回流2h,殘渣再加8倍乙醇加熱回流2h,合并提取液,回收乙醇,得到乙醇提取物,按與原藥材的比例配置成一定濃度混懸水液,(含生藥量0.45g/ml),冷藏備用。
　　 生物堿提取:紅背葉根粗粉500g,95％乙醇浸泡6h后,回流提取2次,每次120分鐘,合并2次濾液,然后加入1/2體積,5％鹽酸,分離出雜質(zhì)及酸水提取液,酸水提取液中加

7、入濃氨水堿化,調(diào)節(jié)PH到9,得到非生物堿部位和游離生物堿部位,游離生物堿部位,用CHCL3萃取三次,分別按1:1,1:2,1:3體積萃取,得到水相及生物堿部位,蒸餾水沈脫3次后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收氯仿,得到總生物堿部位,取該部位少許加入4支小試管,各管依次加入生物堿沉淀劑:碘化鉀、碘化汞鉀、硅鎢酸試劑和碘化鉍鉀各2滴。該部位出現(xiàn)不同程度沉淀反應(yīng),分別為:棕紅色,白色,白色,桔紅色。說明該部位部位含有生物堿成分,重0.22g,按藥效學(xué)原則制成水

8、溶液含生藥量0.44g/kg。
　　 2.紅背葉根各種提取物含藥血清的制備
　　 54只健康 Wistar雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,稱重,隨機分為9組,每組6只,通過給予大鼠分別灌服紅背葉根水提物低劑量,紅背葉根水提物中劑量,紅背葉根水提物高劑量,紅背葉根醇提物低劑量,紅背葉根醇提物中劑量,紅背葉根醇提物高劑量,生物堿,恩替卡韋和生理鹽水7天后,分離藥物血清,制紅背葉根水提物低劑量、紅背葉根水提物中劑量、紅背葉根水提物高

9、劑量、紅背葉根醇提物低劑量、紅背葉根醇提物中劑量、紅背葉根醇提物高劑量、生物堿、陽性對照恩替卡韋和空白血清,血清經(jīng)56℃,30min滅活,置-20℃冰箱保存,待測備用。
　　 結(jié)果:各組含藥血清質(zhì)地均勻,清稀合格,可用于藥效干預(yù)實驗。
　　 實驗四:藥物對細胞的毒性實驗
　　 目的：采用MTT方法,觀察各種紅背葉根各種提取物含藥血清對 HepG2.2.15的細胞毒性作用。
　　 方法： HepG2.2.1

10、5細胞購自博慧斯生物醫(yī)藥有限公司,取第4～8代細胞,以1×104個/L,每孔200μL接種于96孔培養(yǎng)板,隨機分為10組,細胞貼壁后各組換入相應(yīng)含藥血清:紅背葉根水提物低劑量組,紅背葉根水提物中劑量組,紅背葉根水提物高劑量組,紅背葉根醇提物低劑量組,紅背葉根醇提物中劑量組,紅背葉根醇提物高劑量組,生物堿組,陽性對照恩替卡韋組,陰性對照組和空白對照組,每組5孔。陰性對照組換入正常培養(yǎng)液。于加藥d3吸去上清液,每孔加5g/L MTT10μL

11、,37℃孵育4h,棄上清液后每孔加入DMSO150μL,震蕩10min,測 A450nm值；通過公式計算細胞抑制率和半數(shù)中毒濃度(TC50)。
　　 結(jié)果：紅背葉根水提物低、中、高劑量組含藥血清對細胞的抑制率分別為53.7％,39.3％,26.1％,紅背葉根醇提物低、中、高劑量組含藥血清對細胞的抑制率12.7％,11.1％,生物堿組含藥血清為8.2％,空白對照組為6.1％,西藥組4.2％,生物堿組含藥血清的 TC50為0.67g

12、/L；恩替卡韋組含藥血清對細胞的抑制率為43.4％。在此實驗中,生物堿組含藥血清對細胞的抑制與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；生物堿組含藥血清和恩替卡韋組含藥血清在細胞毒性上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 實驗五:細胞培養(yǎng)上清液中 HBsAg和 HBeAg的測定
　　 目的：觀察紅背葉根水提物,醇提物,生物堿含藥血清對 HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的影響。
　　

13、 方法：使用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的 HBsAg和HBeAg,顯色反應(yīng)后,酶標(biāo)儀讀取 A450nm值；通過公式計算抗原抑制率和50％藥物抑制濃度(IC50)。結(jié)果紅背葉根各種提取物組相對于陰性對照組,其所測 A450nm值均降低,且隨著藥物濃度的增加,培養(yǎng)時間的延長,降低愈明顯。0.025g/L紅背葉根生物堿組在d6細胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg和HBeAg與陰性對照組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而其他濃度組在d3,d

14、6兩個時間段細胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg分泌量均和陰性對照組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在d6,紅背葉根對細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的IC50分別為0.096g/L和0.085g/L。
　　 結(jié)果:
　　 1、HepG2.2.15細胞能向培養(yǎng)上清液中穩(wěn)定地分泌HBsAg和HBeAg,其分泌量隨著細胞培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加。
　　 2、紅背葉根生物堿含藥血清對 HepG2.2.15細