乙肝病毒X基因參與肝細(xì)胞脂肪變性的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)與病毒性肝炎的關(guān)系近年來引起學(xué)者們廣泛關(guān)注。研究顯示乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染常合并不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性。我國是慢性乙型肝炎(chronichepatitis B，CHB)大國，發(fā)病率始終居于世界前列，HBsAg陽性

2、者占我國人口的7.18％，約1.2億人，嚴(yán)重影響人們生活水平。慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)與肝脂肪變的關(guān)系較為肯定，而HBV與肝脂肪變性的關(guān)系尚存在諸多爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為HBV感染合并肝脂肪變主要與宿主代謝因素有關(guān)，而與病毒本身關(guān)系不大，而另有研究認(rèn)為HBV與肝脂肪變有密切聯(lián)系，且是引起脂肪肝的主要因素。
　　乙肝病毒x蛋白是乙肝病毒X基因(Hepatitis B virus X gene，HBx)

3、編碼的一種多功能蛋白，在病毒復(fù)制中起重要作用。國外研究表明HBx可與肝X受體(liver X receptors，LXRs)相互作用調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟脂代謝的調(diào)節(jié)。LXRs屬于核受體超家族成員，廣泛參與機(jī)體脂肪代謝、膽固醇代謝等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。HBV感染及相關(guān)性疾病是我國面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，而HBV與脂肪肝的研究在我國剛剛起步，有關(guān)CHB合并脂肪肝的發(fā)病情況、危險(xiǎn)因素、肝細(xì)胞脂肪變性對(duì)CHB病程進(jìn)展的影響、與抗

4、病毒治療應(yīng)答的關(guān)系等諸多未知問題亟待解答。
　　HepG2.2.15細(xì)胞是將HBV DNA整合入人肝癌細(xì)胞(humanhepatoma cell line G2，HepG2)建立的細(xì)胞系，能持續(xù)表達(dá)HBx，是體外研究HBV的重要細(xì)胞模型。HBV是否參與肝脂肪變，其作用和機(jī)制如何是本課題的研究重點(diǎn)，本研究結(jié)果有助于判斷HBV與非酒精性脂肪肝的關(guān)系，也能對(duì)其發(fā)生機(jī)制有一定的認(rèn)識(shí)，為HBV感染合并脂肪肝的防治提供理論基礎(chǔ)。
　　本

5、實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究HepG2.2.15細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中HBx及LXRα基因表達(dá)的差異，構(gòu)建并篩選有效的shHBx及shLXRα干擾質(zhì)粒，通過分別干擾HBx和LXRα基因，以及油酸鈉或LXRα激動(dòng)劑T0901317處理細(xì)胞，觀察HBx對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性及脂代謝基因表達(dá)的影響，探討與LXRα途徑的關(guān)系，以期從分子生物學(xué)角度部分揭示HBV感染與肝細(xì)胞脂肪變性的關(guān)系及可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用RT-PCR和Western b

6、lot方法從mRNA和蛋白水平檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中HBx及LXRα的表達(dá)。
　　2.構(gòu)建針對(duì)HBx基因的特異性干擾質(zhì)粒，比較沉默HBx基因前后肝細(xì)胞脂肪變程度及脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　3.構(gòu)建針對(duì)LXRα基因的特異性干擾質(zhì)粒，比較沉默LXRα基因前后HBx對(duì)肝細(xì)胞脂代謝的影響與LXRα途徑的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)有HBx和 LXRα mRNA及蛋白

7、表達(dá)，HepG2細(xì)胞中未檢測(cè)出HBx表達(dá)，與HepG2.2.15細(xì)胞相比，LXRα表達(dá)較少(P<0.05)。
　　2.成功構(gòu)建針對(duì)HBx基因的特異干擾質(zhì)粒并篩選出其中干擾效果最佳的shHBx3質(zhì)粒。沉默HBx基因后，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，HBx mRNA及蛋白的表達(dá)在HBx1組、HBx2組、HBx3組中均顯著降低(P<0.05)，且與HBx1組和HBx2組比較，HBx3組表達(dá)量最低(P<0.05)。
　　3.未加油酸

8、鈉情況下，沉默HBx后，shHBx3轉(zhuǎn)染組和HepG2組細(xì)胞胞漿中的桔紅色脂肪顆粒、SREBP-1c mRNA、LXRα及FAS蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，而shHBx3轉(zhuǎn)染組和HepG2組差別不大(P>0.05)；沉默HBx后，予油酸鈉處理細(xì)胞，各組TG含量、SREBP-1c mRNA、LXRα及FAS蛋白的表達(dá)隨油酸鈉處理時(shí)間延長逐漸增多，但同一時(shí)間點(diǎn)shHBx3轉(zhuǎn)染組及HepG2組細(xì)胞內(nèi)增加不明顯(P<

9、0.05)，而兩組相比無明顯差異。
　　4.成功構(gòu)建針對(duì)LXRα基因的特異干擾質(zhì)粒并篩選出其中干擾效果最佳的shLXRα1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染LXRα質(zhì)粒后，LXRα mRNA及蛋白表達(dá)在LXRα1組、LXRα2組和LXRα3組中顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，且LXRα1組表達(dá)量明顯低于LXRα2和LXRα3組(P<0.05)
　　5.沉默LXRα后，未加激動(dòng)劑時(shí)，各組HBx蛋白表達(dá)差異不大，而細(xì)胞內(nèi)桔紅色脂肪顆粒、SREBP-1c

10、 mRNA、FAS蛋白在shLXRα1轉(zhuǎn)染組中顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。沉默LXRα后，再加入激動(dòng)劑處理細(xì)胞，同一時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞HBx蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，TG含量、SREBP-1cmRNA和FAS蛋白仍隨刺激時(shí)間延長逐漸增多，但同一時(shí)間點(diǎn)shLXRα1轉(zhuǎn)染組中增加不明顯(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.與表達(dá)HBx的HepG2.2.15細(xì)胞比較，LXRα mRNA及蛋白在HepG2