SsHADV--1影響核盤菌侵染油菜機(jī)制的解析.pdf

1、核盤菌是一種重要的植物病原真菌，且寄主廣泛，由其引起的菌核病危害嚴(yán)重，目前缺乏高效、綠色的防治手段。真菌病毒是侵染真菌的病毒，能夠引起寄主致病力衰退的真菌病毒是潛在的生物防治資源。國內(nèi)外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)多種能夠引起核盤菌致病力衰退的病毒，DNA病毒SsHADV-1就是其中之一。SsHADV-1具有強(qiáng)侵染力，其病毒粒子可侵染核盤菌菌絲，擴(kuò)散受到寄主營養(yǎng)體不親和性的影響小，具有良好的防治菌核病的前景。
　　為了研究SsHADV-1病毒引起核

2、盤菌致病力衰退的機(jī)制，我們運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)比較了攜帶SsHADV-1的菌株DT-8和不攜帶病毒的菌株DT-8VF在活體油菜葉片上基因表達(dá)的差異。收集DT-8和DT-8VF的菌絲片段懸液，分別接種在活體油菜植株的葉片上，置于20℃光照培養(yǎng)室保濕培養(yǎng)。在接種油菜6hpi、12hpi、18hpi和24hpi時(shí)收取菌絲提取總RNA，測序后得到各個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄信息。
　　比較不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)菌株DT-8中與菌株DT-8VF中基因的表達(dá)情況，在

3、核盤菌接種油菜6hpi時(shí)，菌株DT-8中顯著上調(diào)基因816個(gè)，顯著下調(diào)基因587個(gè);12hpi時(shí)顯著上調(diào)基因795個(gè)，顯著下調(diào)基因835個(gè);18hpi時(shí)顯著上調(diào)基因991個(gè)，顯著下調(diào)基因717個(gè);24hpi時(shí)顯著上調(diào)基因981個(gè)，顯著下調(diào)基因756個(gè)。此外，在6hpi、12hpi、18hpi和24hpi時(shí)均顯著差異表達(dá)的基因達(dá)687個(gè)，其中上調(diào)基因435個(gè)，下調(diào)基因252個(gè)，下調(diào)的基因?yàn)榇渭?jí)代謝、聚糖代謝、蛋白結(jié)合、脂肪酸代謝相關(guān)等;均

4、上調(diào)的為DNA修復(fù)、DNA重組和復(fù)制等相關(guān)基因。
　　對(duì)顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能分析、KEGG pathway富集分析，以及FunCat分析，結(jié)合三種分析方法可知，SsHADV-1的侵染主要影響了核盤菌自身的代謝途徑和DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。其中顯著性上調(diào)的基因富集到的通路有:DNA損傷和修復(fù)以及DNA復(fù)制相關(guān)，侵染初期有氧化還原相關(guān)和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的通路，侵染后期與毒素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通路以及氮代謝相關(guān)基因顯著上調(diào)。顯著性下調(diào)的基因富集到的

5、通路為糖類代謝、脂類代謝、毒力因子以及解毒相關(guān)，碳水化合代謝通路和次級(jí)代謝通路相關(guān)基因在接種12hpi和18hpi時(shí)下調(diào)，菌株DT-8中糖基水解酶類（角質(zhì)酶、蛋白酶、細(xì)胞壁降解酶等，參與碳水化合物代謝）基因顯著下調(diào)。篩選獲得了在菌株DT-8中顯著下調(diào)的碳水化合物代謝酶類108個(gè)以及6個(gè)顯著下調(diào)的小分泌蛋白，對(duì)于這些可能參與了核盤菌致病過程的酶類和分泌蛋白需進(jìn)行進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證。
　　DNA病毒的侵染通常會(huì)激發(fā)寄主的DNA損傷修復(fù)

6、反應(yīng)，ku70和ku80是DNA損傷修復(fù)通路—非同源末端結(jié)合中的關(guān)鍵因子。與菌株DT-8VF相比，基因Ssku70和Ssku80在菌株DT-8侵染油菜6hpi、12hpi、18hpi和24hpi時(shí)上調(diào)達(dá)2倍至4倍，且菌株DT-8中這兩個(gè)基因的表達(dá)量隨時(shí)間遞推而增加，而菌株DT-8VF中4個(gè)時(shí)間點(diǎn)下表達(dá)量幾乎沒有變化。為了探究這兩個(gè)基因在核盤菌中的功能，本試驗(yàn)運(yùn)用PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法對(duì)菌株DT-8VF進(jìn)行基因Ssku70和Ssku

7、80的敲除，Ssku70得到5個(gè)敲除轉(zhuǎn)化子，而Ssku80得到3個(gè)敲除轉(zhuǎn)化子，由于核盤菌細(xì)胞具有多核的特性，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明敲除轉(zhuǎn)化子中基因Ssku70和Ssku80仍有表達(dá)，但表達(dá)量顯著下降。對(duì)敲除轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生物學(xué)性狀的測定，發(fā)現(xiàn)基因Ssku70的敲除轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)發(fā)生了明顯扇變，且菌絲更為致密，菌核形成速度減慢;而基因Ssku80的敲除轉(zhuǎn)化子氣生菌絲濃密，但菌核形成與菌株DT-8VF無明顯差異。致病力測定試驗(yàn)結(jié)果表明所有

8、KU敲除轉(zhuǎn)化子的致病力均顯著下降，尤其是基因Ssku70的敲除轉(zhuǎn)化子致病力衰退更明顯，且Ssku70和Ssku80的敲除轉(zhuǎn)化子的致病力也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。推測Ssku70和Ssku80可能通過影響核盤菌的DNA損傷修復(fù)反應(yīng)而影響其致病力，但是對(duì)病毒傳播和積累的影響暫時(shí)未知。
　　本論文首次探究了病毒SsHADV-1、真菌與植物這三者互作過程中核盤菌代謝通路和基因的變化，發(fā)現(xiàn)破壞非同源末端結(jié)合通路中的Ssku70和Ssku80基因