核盤(pán)菌受真菌病毒抑制的基因的鑒定和分析.pdf

1、核盤(pán)菌是油菜上的重要病原真菌，嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，由其引起的菌核病目前仍然沒(méi)有理想的防治措施。真菌病毒侵染后，核盤(pán)菌EP-1PN菌株的表型發(fā)生了顯著的改變，包括致病力衰退、生長(zhǎng)緩慢和菌落形態(tài)異常等。這些表型的變化是核盤(pán)菌基因表達(dá)發(fā)生變化的反映，研究這些基因及其表達(dá)，有助于深入理解核盤(pán)菌的致病機(jī)理，建立新的防治策略。為了鑒定出這些差異表達(dá)的基因，本研究以感染真菌病毒的弱毒株EP-1PN和它的子囊孢子單孢分離物—強(qiáng)毒株EP-1PNAa

2、為材料進(jìn)行了以下研究： 以EP-1PNAa的mRNA為材料建立了cDNA噬菌體文庫(kù)，該文庫(kù)的滴度約為109pfu/ml，空斑率為2.4％。 以弱毒株EP-1PN的不同生長(zhǎng)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA作為探針，與構(gòu)建的不同生長(zhǎng)時(shí)期的核盤(pán)菌強(qiáng)毒力菌株EP-1PNAa(弱毒株EP-1PN的單孢分離物)的cDNA噬菌體文庫(kù)進(jìn)行雜交，挑選出差異表達(dá)的克隆1116個(gè)。 將插入片段大于1000bp的克隆(210個(gè))進(jìn)行測(cè)列分析

3、，并在NCBI上將這些序列進(jìn)行nr數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTX相似性搜索，去除重復(fù)之后，139個(gè)克隆的序列與該數(shù)據(jù)庫(kù)的序列具有一定程度的相似性，12個(gè)序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有相似性序列存在。根據(jù)比較結(jié)果將推定的不同功能的基因按照MIPS基因功能分類(lèi)方法進(jìn)行了分類(lèi)。從功能的分類(lèi)結(jié)果上看，被抑制表達(dá)的克隆所代表的基因功能涉及到代謝、能量、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、蛋白命運(yùn)、物質(zhì)運(yùn)輸、液泡運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架生物合成、細(xì)胞防御、細(xì)胞骨架排列以及未分類(lèi)蛋白等12類(lèi)

4、。其中可能與核盤(pán)菌和其它病原菌致病過(guò)程相關(guān)的克隆主要有三類(lèi)：細(xì)胞防御、蛋白命運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)，占總克隆的20％。 在此基礎(chǔ)上，對(duì)所獲得的210個(gè)克隆進(jìn)行了反向Northern和部分基因的Northern雜交分析。反向Northern結(jié)果顯示挑選的克隆與強(qiáng)毒株mRNA探針雜交時(shí)絕大多數(shù)均有信號(hào)，而與弱毒株mRNA探針雜交時(shí)極少數(shù)才有信號(hào)。表明差異篩選具有較高的可靠性，同時(shí)說(shuō)明真菌病毒影響寄主基因表達(dá)的廣泛性。選取其中的18個(gè)克隆進(jìn)行了

5、不同時(shí)期RNA表達(dá)水平的Northern雜交檢測(cè)，其中12個(gè)(66％)克隆的表達(dá)在強(qiáng)毒、弱毒株之間表現(xiàn)出明顯的信號(hào)差異，即強(qiáng)毒株中有顯著的信號(hào)，而弱毒株中雜交信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)，表明這些克隆所代表的基因在病毒侵染的核盤(pán)菌弱毒株中被抑制表達(dá)。這12個(gè)克隆包括核盤(pán)菌重要的致病相關(guān)因子內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶(endopolygalacturonase)，在M.grisea及其它病原真菌和動(dòng)植物中參與毒力形成的親環(huán)素(Cyclophilin)及在Bl

6、umeriagraminis和M.grisea等中參與真菌與寄主互作的aldo-ketoreductasehomologue。其它還包括參與蛋白調(diào)節(jié)作用的鋅指蛋白(zinc-fingerprotein)，能量合成相關(guān)磷酸甘油酸酯激酶(Phosphoglyceratekinase)和磷酸甘油酸脫水酶2-phosphoglyceratedehydratase(Enolase)，蛋白合成前體40Sribosomalprotein，參與離子運(yùn)輸

7、的無(wú)機(jī)焦磷酸酶(Ippase)，這些基因可能參與核盤(pán)菌的致病過(guò)程，但對(duì)致病力的貢獻(xiàn)，尚待進(jìn)一步的研究。 本研究對(duì)克隆MVSG530進(jìn)行了更深一步的研究，同源性比較發(fā)現(xiàn)該基因是在許多生物體中都十分保守的一類(lèi)基因家族，這類(lèi)基因家族對(duì)病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病力的形成普遍都起關(guān)鍵的作用，我們根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)用免疫抑制藥物環(huán)孢菌素CsA對(duì)核盤(pán)菌生長(zhǎng)菌絲進(jìn)行處理，結(jié)果表明核盤(pán)菌中存在CsA作用的活性位點(diǎn)，即Cyclophilin基因，實(shí)驗(yàn)初步結(jié)