核盤菌受真菌病毒抑制的基因的鑒定和分析.pdf

1、核盤菌是油菜上的重要病原真菌，嚴重影響油菜的產(chǎn)量和品質，由其引起的菌核病目前仍然沒有理想的防治措施。真菌病毒侵染后，核盤菌EP-1PN菌株的表型發(fā)生了顯著的改變，包括致病力衰退、生長緩慢和菌落形態(tài)異常等。這些表型的變化是核盤菌基因表達發(fā)生變化的反映，研究這些基因及其表達，有助于深入理解核盤菌的致病機理，建立新的防治策略。為了鑒定出這些差異表達的基因，本研究以感染真菌病毒的弱毒株EP-1PN和它的子囊孢子單孢分離物—強毒株EP-1PNAa

2、為材料進行了以下研究： 以EP-1PNAa的mRNA為材料建立了cDNA噬菌體文庫，該文庫的滴度約為109pfu/ml，空斑率為2.4％。 以弱毒株EP-1PN的不同生長時期的mRNA反轉錄cDNA作為探針，與構建的不同生長時期的核盤菌強毒力菌株EP-1PNAa(弱毒株EP-1PN的單孢分離物)的cDNA噬菌體文庫進行雜交，挑選出差異表達的克隆1116個。 將插入片段大于1000bp的克隆(210個)進行測列分析

3、，并在NCBI上將這些序列進行nr數(shù)據(jù)庫的BLASTX相似性搜索，去除重復之后，139個克隆的序列與該數(shù)據(jù)庫的序列具有一定程度的相似性，12個序列在數(shù)據(jù)庫中沒有相似性序列存在。根據(jù)比較結果將推定的不同功能的基因按照MIPS基因功能分類方法進行了分類。從功能的分類結果上看，被抑制表達的克隆所代表的基因功能涉及到代謝、能量、轉錄、蛋白合成、蛋白命運、物質運輸、液泡運輸、信號傳導、細胞骨架生物合成、細胞防御、細胞骨架排列以及未分類蛋白等12類

4、。其中可能與核盤菌和其它病原菌致病過程相關的克隆主要有三類：細胞防御、蛋白命運和信號傳導，占總克隆的20％。 在此基礎上，對所獲得的210個克隆進行了反向Northern和部分基因的Northern雜交分析。反向Northern結果顯示挑選的克隆與強毒株mRNA探針雜交時絕大多數(shù)均有信號，而與弱毒株mRNA探針雜交時極少數(shù)才有信號。表明差異篩選具有較高的可靠性，同時說明真菌病毒影響寄主基因表達的廣泛性。選取其中的18個克隆進行了

5、不同時期RNA表達水平的Northern雜交檢測，其中12個(66％)克隆的表達在強毒、弱毒株之間表現(xiàn)出明顯的信號差異，即強毒株中有顯著的信號，而弱毒株中雜交信號弱或無信號，表明這些克隆所代表的基因在病毒侵染的核盤菌弱毒株中被抑制表達。這12個克隆包括核盤菌重要的致病相關因子內源多聚半乳糖醛酸酶(endopolygalacturonase)，在M.grisea及其它病原真菌和動植物中參與毒力形成的親環(huán)素(Cyclophilin)及在Bl

6、umeriagraminis和M.grisea等中參與真菌與寄主互作的aldo-ketoreductasehomologue。其它還包括參與蛋白調節(jié)作用的鋅指蛋白(zinc-fingerprotein)，能量合成相關磷酸甘油酸酯激酶(Phosphoglyceratekinase)和磷酸甘油酸脫水酶2-phosphoglyceratedehydratase(Enolase)，蛋白合成前體40Sribosomalprotein，參與離子運輸

7、的無機焦磷酸酶(Ippase)，這些基因可能參與核盤菌的致病過程，但對致病力的貢獻，尚待進一步的研究。 本研究對克隆MVSG530進行了更深一步的研究，同源性比較發(fā)現(xiàn)該基因是在許多生物體中都十分保守的一類基因家族，這類基因家族對病原菌的生長發(fā)育及致病力的形成普遍都起關鍵的作用，我們根據(jù)前人的經(jīng)驗用免疫抑制藥物環(huán)孢菌素CsA對核盤菌生長菌絲進行處理，結果表明核盤菌中存在CsA作用的活性位點，即Cyclophilin基因，實驗初步結