氯乙烯亞慢性染毒對大鼠肝組織和外周血周期相關microRNAs表達的影響.pdf

1、目的：
　　檢測氯乙烯染毒大鼠肝組織中周期相關 miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表達的改變，探討其在肝細胞周期改變中的作用；同時檢測血清中相應miRNAs的表達，為氯乙烯暴露早期標志物的研究提供依據。
　　方法：
　　1.動物處理：按體重將96只SPF級雄性SD大鼠隨機分為三個染毒組（5mg/kg組、25mg/kg組和125mg/kg組）和對照組，每組24只

2、。采用腹腔注射相應體積的氯乙烯氣體進行染毒，對照組注射25mg/kg清潔空氣,每周3次。分別于染毒第6周、8周、12周末，每組隨機選取8只大鼠收集肝組織和血液。
　　2.肝細胞周期檢測：新鮮肝組織約100mg制備細胞懸液，用預冷的70％乙醇4℃過夜固定細胞，然后用400μlPI染液暗處染色30min（期間搖晃數次），最后使用流式細胞儀進行檢測。
　　3.實時熒光定量PCR：將提取合格的RNA（肝組織提?。?00nt的小片段R

3、NA，血清中提取總RNA）反轉錄合成cDNA，實時熒光定量（SYBR染料法）檢測不同染毒時間各 miRNAs的表達量。獲得每個樣本的擴增產物Ct值，結果采用2-△△Ct法計算各miRNAs相對于對照組的表達量。
　　4.統(tǒng)計方法：所有數據均使用spss19.0進行整理和分析。對數據進行方差齊性檢驗；若方差齊，進行單因素方差分析，若方差不齊，進行秩和檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗）；檢驗水準為0.05。定量數據如服從正態(tài)

4、分布，則以x-±s表示；不服從正態(tài)分布，則以中位數和四分位數間距表示。
　　結果：
　　1.大鼠狀況：染毒期間，動物狀況良好，沒有出現明顯中毒癥狀。
　　2.肝細胞周期檢測：第6周，125mg/kg組G0/G1期細胞百分比（75.61±9.10%）與對照組（66.83±9.30%）相比增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第8周，三個劑量組 G0/G1期、S期和G2/M期細胞百分比與對照組相比均無統(tǒng)計學差異（P＞0

5、.05）；第12周，125mg/kg組S期細胞百分比（10.03±3.58%）與對照組（5.79±2.55%）相比增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3.肝組織中 miRNAs的表達：5種 miRNAs的相對表達量均呈現出明顯的劑量效應和時間效應。隨著染毒劑量的增加：第6周，各miRNAs的相對表達量顯著上調（P＜0.05）；第8周，mir-125b、mir-21的相對表達量顯著下調（P＜0.05）；第12周，各 mi

6、RNAs的相對表達量顯著下調（P＜0.05）。隨著時間的延長：對照組和5mg/kg組，各miRNAs的相對表達量差異無顯著性（P＞0.05）；25mg/kg組和125mg/kg組，各miRNAs的相對表達量顯著下調（P＜0.05），且125mg/kg組下調更明顯，但25mg/kg組mir-195的相對表達量各時間點差異無顯著性（P＞0.05）。從染毒第8周開始，各miRNAs在25mg/kg組和125mg/kg組的相對表達量均低于對照組

7、(5mg/kg組與對照組相比表達略增高，但差異無統(tǒng)計學意義)，且隨著劑量的增加和時間的延長下調更加明顯。
　　4.血清中miRNAs的表達：mir-122、mir-125b、mir-21的相對表達量均不顯示顯著的劑量效應和時間效應。mir-192相對表達量有顯著的時間效應（P＜0.05），表現為先增加后降低，但兩兩比較無統(tǒng)計學差異；mir-195相對表達量有顯著的時間效應（P＜0.05），表現為先降低后增加，但兩兩比較無統(tǒng)計學差異

8、。
　　5.肝組織和血清中miRNAs相關性分析：進行肝組織和血清中表達的相關性分析，5種miRNAs均未發(fā)現有顯著相關性（P＞0.05）。
　　結論：
　　1.氯乙烯破壞肝細胞G1/S關卡，使肝細胞短時間停滯于G1期，隨著時間的延長，細胞進入S期的比例增加。
　　2.氯乙烯染毒6周，大鼠肝組織 miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表達上調，從第8周開始下

9、調，并且到第12周時下調更加顯著。
　　3.肝組織miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表達量的變化可能與肝細胞周期G1/S關卡調控有關。
　　4.低豐度的miRNAs可能在氯乙烯致肝損傷中發(fā)揮重要作用。
　　5.在肝組織與血清中，miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195和mir-21）表達量的變化不同。
　　6.血清m