PDTC對暴發(fā)性肝衰竭大鼠肝組織NF-κB表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：暴發(fā)性肝衰竭（fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF）是一種病死率極高的臨床綜合征，目前除肝移植外尚無特效的治療措施，而肝源短缺、費用昂貴、術(shù)后長期應(yīng)用免疫抑制劑限制了其在臨床的實施，因此，尋找有效的臨床內(nèi)科治療方法十分必要。然而發(fā)病機制的明確是創(chuàng)新科學(xué)、有效的治療措施的基礎(chǔ)。近年來，有關(guān)暴發(fā)性肝衰竭的研究取得了諸多進(jìn)展，但是其具體機制尚不十分清楚。
　　 有學(xué)者提出炎癥因子網(wǎng)絡(luò)的激活在FHF的發(fā)生中起

2、著重要作用，尤其是對位于炎癥網(wǎng)絡(luò)中心地位的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的研究，成為最近十年的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB可以通過啟動轉(zhuǎn)錄多種炎癥因子的表達(dá)促進(jìn)炎癥進(jìn)展，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthesis，iNOS）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。暴發(fā)性肝衰竭的病理研究認(rèn)為除了肝細(xì)胞壞死，大量肝細(xì)胞凋亡參與了其病理過程

3、。NF-κB能啟動轉(zhuǎn)錄很多下游基因的表達(dá)，這些基因表達(dá)的產(chǎn)物不但參與了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而且在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。NF-κB調(diào)控著一系列凋亡誘導(dǎo)和凋亡抑制基因的表達(dá)，包括凋亡蛋白酶（caspase）、死亡受體、凋亡抑制蛋白家族部分成員、Bcl-2蛋白家族部分成員以及某些原癌基因。但是由于刺激NF-κB活化的因素不同，活化的靶基因不同，NF-κB在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面也發(fā)揮著不同的作用，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑既可抑制肝細(xì)胞的凋亡亦可促進(jìn)肝細(xì)胞的

4、調(diào)亡。目前國內(nèi)外對NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭中肝細(xì)胞凋亡的作用研究較少。因此NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭肝細(xì)胞凋亡中的作用及其機制尚不清楚。
　　 本研究采用Wistar大鼠腹腔注射D氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）后皮內(nèi)注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制造暴發(fā)性肝衰竭動物模型，并將應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate

5、，PDTC）預(yù)處理的大鼠與模型組大鼠進(jìn)行比較。通過采用常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）判斷比較抑制NF-κB表達(dá)前后肝組織細(xì)胞凋亡的情況，了解PDTC在

6、暴發(fā)性肝衰竭中對NF-κB表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡的影響，初步探討NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭肝細(xì)胞凋亡中的作用。應(yīng)用免疫組化及反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）方法，從蛋白、基因水平檢測c-myc、survivin表達(dá)，探討NF-κB是否通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因c-myc、survivin的表達(dá)參與暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病。為臨床如何應(yīng)用NF-κB抑制劑治療肝衰

7、竭提供理論依據(jù)。
　　 方法：1、研究對象：雄性Wistar大鼠60只，清潔級，體重180-200g。大鼠禁食24小時后，隨機分為2組，即模型組和PDTC組，每組30只。模型組應(yīng)用D-GalN800mg/kg+LPS10ug/kg制造暴發(fā)性肝衰竭模型；PDTC組應(yīng)用PDTC100mg/kg預(yù)處理，余同模型組。2、標(biāo)本采集和保存：從PDTC組、模型組各取6只分別于給D-GalN+LPS后2、4、8、12、24小時行股靜脈放血處死，

8、迅速小心剖出肝臟，取適量肝組織分別固定于10％中性甲醛液、70％乙醇中，部分肝組織液氮冰凍后存放于-80℃冰箱；將全血放置30min，離心取上層血清行生化學(xué)檢測。3、HE染色光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。4、采用Olympus AU2700全自動生化分析儀對兩組大鼠血清進(jìn)行肝功能檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）及總膽紅素（total bilirubin，TB）。5、采用免疫組織化學(xué)S-P法對

9、肝組織標(biāo)本進(jìn)行NF-κBp65、c-Myc、survivin蛋白染色。6、采用RT-PCR方法對NF-κB、c-myc、survivin mRNA進(jìn)行半定量分析。7、應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)測定70％乙醇固定的兩組肝組織細(xì)胞凋亡率（apoptotic rate，AR），進(jìn)行分析比較。8、TUNEL法檢測兩組肝組織原位肝細(xì)胞凋亡情況，凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。9、統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用spss1

10、1.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用秩和檢驗和Spearman秩相關(guān)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。
　　 結(jié)果：
　　 1、一般狀況觀察：模型組大鼠隨著給藥時間的延長出現(xiàn)活動減少、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)豎立、嗜睡、昏迷等情況；PDTC組大鼠一般狀況好于模型組，給藥后24小時只有毛發(fā)豎立、活動少等表現(xiàn)，無嗜睡、昏迷等肝性腦病表現(xiàn)。
　　 2、肝組織形態(tài)學(xué)觀察：（1）大體標(biāo)本觀察：模型組大鼠肝臟隨著給藥時間的延長出血點及淤血斑均逐漸增多

11、，到24小時肝組織呈暗紅色，大片出血，淤血嚴(yán)重；PDTC組隨著給藥時間的延長，只有出血點增多，至24小時仍未見大片出血、淤血現(xiàn)象。（2）HE染色：模型組大鼠肝組織病理顯示給藥后2小時肝小葉完整，肝索排列規(guī)則；4小時可見肝細(xì)胞嗜酸性變及凋亡小體，少量炎細(xì)胞浸潤；8小時可見灶狀壞死，伴炎細(xì)胞浸潤，可見多量凋亡小體；12小時肝細(xì)胞片狀壞死，可見炎細(xì)胞浸潤，可見凋亡肝細(xì)胞；24小時肝組織大片壞死，出血嚴(yán)重，殘留散在肝細(xì)胞及凋亡小體；PDTC組大

12、鼠肝細(xì)胞壞死、凋亡較模型組均明顯減輕。
　　 3、生化檢測結(jié)果：模型組大鼠血清ALT及TB水平隨著給藥時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，12、24小時急劇升高；PDTC組大鼠血清ALT、TB較模型組降低，各時間點兩組之間p值分別為（ALT：0.025、0.037、0.631、0.004、0.004；TB：0.747、0.045、0.872、0.004、0.004）。
　　 4、細(xì)胞凋亡的變化：流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率及TUNE

13、L法計算凋亡指數(shù)結(jié)果均顯示模型組呈現(xiàn)上升趨勢（p<0.05）；PDTC組較模型組細(xì)胞凋亡減少（p<0.05）。
　　 5、NF-κB的表達(dá)變化：模型組大鼠肝組織隨著給藥時間的延長，在基因及蛋白水平表達(dá)均呈現(xiàn)上升趨勢（p<0.05）；PDTC組較模型組下降（p<0.05）。
　　 6、c-myc、survivin表達(dá)變化：模型組肝組織c-myc、survivin mRNA表達(dá)在4、24呈現(xiàn)雙峰，PDTC組肝組織surviv

14、in。mRNA表達(dá)較模型組無明顯下降（p>0.05），c-mycmRNA在4、8、24小時較模型組表達(dá)下降（p<0.05），2、24小時無明顯下降（p>0.05）；模型組肝組織c-Myc蛋白表達(dá)在4、24小時呈現(xiàn)雙峰，Survivin呈現(xiàn)上升趨勢，PDTC組肝組織表達(dá)較模型組無明顯下降（p>0.05）。
　　 7、Survivin、c-myc表達(dá)與細(xì)胞凋亡率相關(guān)性分析：survivin、c-myc表達(dá)與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)（r=-

15、0.491、-0.414，p=0.000、0.004）。
　　 結(jié)論：
　　 1、利用D-GalN聯(lián)合LPS制造暴發(fā)性肝衰竭大鼠模型，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及基因水平證實了肝細(xì)胞凋亡在暴發(fā)性肝衰竭病理過程中起著重要作用。
　　 2、從細(xì)胞、蛋白和基因水平證實NF-κB在D-GalN+LPS所致實驗性暴發(fā)性肝衰竭發(fā)病中除了促炎作用，還能誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。
　　 3、從蛋白和基因水平證實了在D-GalN+LPS所致

16、實驗性暴發(fā)性肝衰竭中抗氧化劑PDTC能有效抑制NF-κB的表達(dá)。
　　 4、PDTC能通過抑制NF-κB活性，減輕D-GalN+LPS所致暴發(fā)性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞凋亡，改善病情，為臨床應(yīng)用NF-κB抑制劑治療肝衰竭提供了理論依據(jù)。
　　 5、c-Myc、survivin在D-GalN+LPS所致實驗性暴發(fā)性肝衰竭中具有抑制肝細(xì)胞凋亡的作用，但NF-κB對其無明確的調(diào)控作用，提示NF-κB調(diào)控肝細(xì)胞凋亡的機制復(fù)雜，尚需進(jìn)一步