亞慢性過(guò)量氟暴露對(duì)大鼠骨組織中骨涎蛋白表達(dá)水平的影響.pdf

1、氟是一種低劑量時(shí)為人體生理代謝所必需但過(guò)量攝入可造成人體全身性毒性損傷的微量元素。地方性氟中毒(簡(jiǎn)稱地氟病)是由于人們生活在高氟環(huán)境中長(zhǎng)期攝入過(guò)量的氟而造成的全身慢性中毒性疾病，是一種呈世界性廣泛分布的生物地球化學(xué)性疾病。全球已有50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道地方性氟中毒的存在，據(jù)WHO估計(jì)，全球氟中毒人數(shù)可能超過(guò)7000萬(wàn)人，而中國(guó)接近4000萬(wàn)。目前，全國(guó)地氟病病區(qū)人口約為1.16億，病區(qū)縣除上海市和海南省外，其他各省、區(qū)均有分布。地氟病對(duì)

2、機(jī)體的損害主要可分為骨相損害和非骨相損害，其中尤以骨相損害為重。骨相損害主要表現(xiàn)為氟骨癥和氟斑牙。氟骨癥是慢性氟中毒最主要也是最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，其病理表現(xiàn)多種多樣，其中高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，即骨轉(zhuǎn)換加速是其重要特征。氟骨癥的骨硬化主要是成骨活動(dòng)加強(qiáng)而不是破骨活動(dòng)減弱的結(jié)果，氟骨癥的各種病理改變的表現(xiàn)都是骨吸收與骨形成正常動(dòng)態(tài)平衡的破壞。 骨涎蛋白(BSP)是一種高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白，其主要與羥磷灰石結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞黏附于骨表面，

3、與羥磷灰石核心形成及骨再建過(guò)程有關(guān)，在新形成骨及骨再建活躍部位高表達(dá)，調(diào)控未分化細(xì)胞向活性成骨細(xì)胞分化，對(duì)成骨細(xì)胞的趨化、粘附和分化及基質(zhì)的礦化有重要作用．骨生物學(xué)研究已證實(shí)BSP是骨轉(zhuǎn)換過(guò)程中的一種重要的骨細(xì)胞外基質(zhì)非膠原蛋白。根據(jù)其骨分子生物學(xué)作用推測(cè)BSP在氟骨癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮一定的作用。但經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，關(guān)于亞慢性過(guò)量氟暴露時(shí)BSP在骨組織中的表達(dá)特點(diǎn)迄今尚未見(jiàn)報(bào)道，目前僅見(jiàn)徐志靈等進(jìn)行的過(guò)量氟對(duì)牙組織發(fā)育中BSP分

4、泌的研究。本研究旨在通過(guò)觀察亞慢性過(guò)量氟暴露時(shí)BSP在實(shí)驗(yàn)大鼠骨組織中的表達(dá)特點(diǎn)，為闡明地方性氟中毒的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)和新的思路。 材料與方法: 一、動(dòng)物分組 選取購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部的離乳1周的雄性Wistar大鼠60只，體重(80±10)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重均衡的原則隨機(jī)分為4組，每組15只。四個(gè)劑量組分別為：對(duì)照組(飲自來(lái)水)、低氟組(飲水含氟50mgF/L)、中氟組(飲水含氟100mg

5、F/L)和高氟組(飲水含氟150mg F/L)，各組大鼠喂飼全營(yíng)養(yǎng)顆粒大鼠飼料，自由進(jìn)水及進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)周期為3個(gè)月，于實(shí)驗(yàn)的第1、2和3月末個(gè)組分別在采集尿樣和血樣后處死5只大鼠，采集骨樣。 二、指標(biāo)檢測(cè) (一)大鼠體內(nèi)氟負(fù)荷與日尿氟排泄量測(cè)定大鼠體內(nèi)氟負(fù)荷以血清氟和骨氟含量表示。骨氟含量以管式爐高溫燃燒水解法-氟離子選擇電極法測(cè)定。血清氟和尿氟含量以氟離子選擇電極法測(cè)定。 (二)BSP的免疫組織化學(xué)染色及顯微圖像

6、分析將大鼠股骨樣品固定5天，脫鈣，分切整理，脫水，石蠟包埋，制作5μm石蠟切片，用于HE染色及免疫組化染色。以BSP兔抗大鼠多克隆抗體作為一抗，以生物素化山羊抗兔IgG作為二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，用于低倍鏡下(10×)觀察。將免疫組化切片置于OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下(40×)，將數(shù)值化圖像輸入OLYMPUS多媒體圖像分析系統(tǒng)，把陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，對(duì)免疫組化陽(yáng)性區(qū)域的染色強(qiáng)度進(jìn)行

7、半定量分析。每例隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，測(cè)定BSP免疫組化染色平均綜合光密度，取每張切片的均值作為該例的測(cè)量值。 三、統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS12.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、大鼠一般狀況及氟斑牙發(fā)生發(fā)展情況實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組大鼠被毛光滑、有光澤，活動(dòng)度好。染氟組大鼠被毛失去光澤，活動(dòng)度較差。不同濃度的染氟組大鼠出現(xiàn)不同程度的氟斑牙表現(xiàn)，且隨著染氟時(shí)間的延長(zhǎng)和染氟劑量的升高

8、，氟斑牙的損傷程度明顯加重。 二、尿氟、血清氟和骨氟的水平在同一個(gè)染氟月份內(nèi)，三個(gè)染氟組大鼠的尿氟、血清氟和骨氟水平明顯高于對(duì)照組大鼠的尿氟、血清氟和骨氟水平，且尿氟、血清氟和骨氟水平隨染氟劑量的增加而升高。在同一個(gè)染氟濃度下，尿氟、血清氟和骨氟水平隨著染氟時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高。 三、骨組織的形態(tài)觀察及BSP免疫組化染色 (一)HE染色結(jié)果低倍鏡下(10×)可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，染氟組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。隨著染

9、氟時(shí)間的延長(zhǎng)和染毒劑量的升高，骨細(xì)胞的數(shù)量隨之增多，骨小梁增生、變粗、排列紊亂。 (二)BSP免疫組化染色結(jié)果高倍鏡下(40×)可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠的骨組織中，BSP表達(dá)于骨皮質(zhì)中的成骨細(xì)胞和骨髓腔內(nèi)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(成骨細(xì)胞前體細(xì)胞)中。陽(yáng)性染色是胞漿為棕色著色，而細(xì)胞核為藍(lán)色著色；陰性染色則是僅僅細(xì)胞核為藍(lán)色著色。與對(duì)照組比較，染氟組大鼠骨組織的骨皮質(zhì)和骨髓腔中骨髓基質(zhì)細(xì)胞中BSP的陽(yáng)性表達(dá)均顯著增強(qiáng)。隨著染氟時(shí)間的延長(zhǎng)和染毒劑量

10、的升高，成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中BSP的陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)。 四、BSP表達(dá)水平的半定量分析在同一個(gè)染氟月份內(nèi)，各染氟組的平均綜合光密度值均明顯高于對(duì)照組，表明各染氟組的BSP表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。在同一個(gè)染氟劑量組中，BSP的平均綜合光密度值隨著染氟時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高。 五、BSP表達(dá)強(qiáng)度與骨氟含量的相關(guān)分析在同一染氟月份中，大鼠骨組織中BSP陽(yáng)性表達(dá)的平均綜合光密度與骨氟含量呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(染氟大鼠1、2、3月骨組織