亞慢性過量氟暴露對大鼠骨組織中骨涎蛋白表達(dá)水平的影響.pdf

1、氟是一種低劑量時(shí)為人體生理代謝所必需但過量攝入可造成人體全身性毒性損傷的微量元素。地方性氟中毒(簡稱地氟病)是由于人們生活在高氟環(huán)境中長期攝入過量的氟而造成的全身慢性中毒性疾病，是一種呈世界性廣泛分布的生物地球化學(xué)性疾病。全球已有50多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道地方性氟中毒的存在，據(jù)WHO估計(jì)，全球氟中毒人數(shù)可能超過7000萬人，而中國接近4000萬。目前，全國地氟病病區(qū)人口約為1.16億，病區(qū)縣除上海市和海南省外，其他各省、區(qū)均有分布。地氟病對

2、機(jī)體的損害主要可分為骨相損害和非骨相損害，其中尤以骨相損害為重。骨相損害主要表現(xiàn)為氟骨癥和氟斑牙。氟骨癥是慢性氟中毒最主要也是最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，其病理表現(xiàn)多種多樣，其中高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，即骨轉(zhuǎn)換加速是其重要特征。氟骨癥的骨硬化主要是成骨活動(dòng)加強(qiáng)而不是破骨活動(dòng)減弱的結(jié)果，氟骨癥的各種病理改變的表現(xiàn)都是骨吸收與骨形成正常動(dòng)態(tài)平衡的破壞。 骨涎蛋白(BSP)是一種高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白，其主要與羥磷灰石結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞黏附于骨表面，

3、與羥磷灰石核心形成及骨再建過程有關(guān)，在新形成骨及骨再建活躍部位高表達(dá)，調(diào)控未分化細(xì)胞向活性成骨細(xì)胞分化，對成骨細(xì)胞的趨化、粘附和分化及基質(zhì)的礦化有重要作用．骨生物學(xué)研究已證實(shí)BSP是骨轉(zhuǎn)換過程中的一種重要的骨細(xì)胞外基質(zhì)非膠原蛋白。根據(jù)其骨分子生物學(xué)作用推測BSP在氟骨癥的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮一定的作用。但經(jīng)檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，關(guān)于亞慢性過量氟暴露時(shí)BSP在骨組織中的表達(dá)特點(diǎn)迄今尚未見報(bào)道，目前僅見徐志靈等進(jìn)行的過量氟對牙組織發(fā)育中BSP分

4、泌的研究。本研究旨在通過觀察亞慢性過量氟暴露時(shí)BSP在實(shí)驗(yàn)大鼠骨組織中的表達(dá)特點(diǎn)，為闡明地方性氟中毒的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)和新的思路。 材料與方法: 一、動(dòng)物分組 選取購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部的離乳1周的雄性Wistar大鼠60只，體重(80±10)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重均衡的原則隨機(jī)分為4組，每組15只。四個(gè)劑量組分別為：對照組(飲自來水)、低氟組(飲水含氟50mgF/L)、中氟組(飲水含氟100mg

5、F/L)和高氟組(飲水含氟150mg F/L)，各組大鼠喂飼全營養(yǎng)顆粒大鼠飼料，自由進(jìn)水及進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)周期為3個(gè)月，于實(shí)驗(yàn)的第1、2和3月末個(gè)組分別在采集尿樣和血樣后處死5只大鼠，采集骨樣。 二、指標(biāo)檢測 (一)大鼠體內(nèi)氟負(fù)荷與日尿氟排泄量測定大鼠體內(nèi)氟負(fù)荷以血清氟和骨氟含量表示。骨氟含量以管式爐高溫燃燒水解法-氟離子選擇電極法測定。血清氟和尿氟含量以氟離子選擇電極法測定。 (二)BSP的免疫組織化學(xué)染色及顯微圖像

6、分析將大鼠股骨樣品固定5天，脫鈣，分切整理，脫水，石蠟包埋，制作5μm石蠟切片，用于HE染色及免疫組化染色。以BSP兔抗大鼠多克隆抗體作為一抗，以生物素化山羊抗兔IgG作為二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用于低倍鏡下(10×)觀察。將免疫組化切片置于OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下(40×)，將數(shù)值化圖像輸入OLYMPUS多媒體圖像分析系統(tǒng)，把陽性表達(dá)的強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，對免疫組化陽性區(qū)域的染色強(qiáng)度進(jìn)行

7、半定量分析。每例隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，測定BSP免疫組化染色平均綜合光密度，取每張切片的均值作為該例的測量值。 三、統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS12.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、大鼠一般狀況及氟斑牙發(fā)生發(fā)展情況實(shí)驗(yàn)期間，對照組大鼠被毛光滑、有光澤，活動(dòng)度好。染氟組大鼠被毛失去光澤，活動(dòng)度較差。不同濃度的染氟組大鼠出現(xiàn)不同程度的氟斑牙表現(xiàn)，且隨著染氟時(shí)間的延長和染氟劑量的升高

8、，氟斑牙的損傷程度明顯加重。 二、尿氟、血清氟和骨氟的水平在同一個(gè)染氟月份內(nèi)，三個(gè)染氟組大鼠的尿氟、血清氟和骨氟水平明顯高于對照組大鼠的尿氟、血清氟和骨氟水平，且尿氟、血清氟和骨氟水平隨染氟劑量的增加而升高。在同一個(gè)染氟濃度下，尿氟、血清氟和骨氟水平隨著染氟時(shí)間的延長而不斷升高。 三、骨組織的形態(tài)觀察及BSP免疫組化染色 (一)HE染色結(jié)果低倍鏡下(10×)可見，與對照組比較，染氟組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。隨著染

9、氟時(shí)間的延長和染毒劑量的升高，骨細(xì)胞的數(shù)量隨之增多，骨小梁增生、變粗、排列紊亂。 (二)BSP免疫組化染色結(jié)果高倍鏡下(40×)可見，對照組大鼠的骨組織中，BSP表達(dá)于骨皮質(zhì)中的成骨細(xì)胞和骨髓腔內(nèi)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(成骨細(xì)胞前體細(xì)胞)中。陽性染色是胞漿為棕色著色，而細(xì)胞核為藍(lán)色著色；陰性染色則是僅僅細(xì)胞核為藍(lán)色著色。與對照組比較，染氟組大鼠骨組織的骨皮質(zhì)和骨髓腔中骨髓基質(zhì)細(xì)胞中BSP的陽性表達(dá)均顯著增強(qiáng)。隨著染氟時(shí)間的延長和染毒劑量

10、的升高，成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中BSP的陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)。 四、BSP表達(dá)水平的半定量分析在同一個(gè)染氟月份內(nèi)，各染氟組的平均綜合光密度值均明顯高于對照組，表明各染氟組的BSP表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。在同一個(gè)染氟劑量組中，BSP的平均綜合光密度值隨著染氟時(shí)間的延長而不斷升高。 五、BSP表達(dá)強(qiáng)度與骨氟含量的相關(guān)分析在同一染氟月份中，大鼠骨組織中BSP陽性表達(dá)的平均綜合光密度與骨氟含量呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(染氟大鼠1、2、3月骨組織