Cdc42調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過(guò)程中的軟骨組織退變和軟骨下骨病變.pdf

1、關(guān)節(jié)炎最為常見(jiàn)的類(lèi)型是骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，它是由關(guān)節(jié)軟骨退變引起的，且以關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的疾病，其病理特征包括關(guān)節(jié)軟骨組織退變、軟骨下骨硬化、骨贅生成、關(guān)節(jié)炎癥、軟骨組織的血管和神經(jīng)侵入等。在常見(jiàn)三大老年病中，骨關(guān)節(jié)炎患病率和患病人數(shù)居于首位。至今還沒(méi)有一種藥物對(duì)OA的治療效果達(dá)到令人滿意的程度，現(xiàn)有的藥物主要針對(duì)疼痛治療，而手術(shù)治療僅是迫不得已的手段，并不能解決骨關(guān)節(jié)炎中軟骨損傷問(wèn)題。因

2、此，深入研究骨關(guān)節(jié)炎特別膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)的分子機(jī)制對(duì)于疾病預(yù)防、診斷和治療意義重大。
　　早前研究主要針對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織，但臨床治療和基礎(chǔ)研究的不一致性意味著單一針對(duì)軟骨組織并不能有效改善骨關(guān)節(jié)炎。近年來(lái)越來(lái)越多研究認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎是種全關(guān)節(jié)疾病，伴隨有軟骨下骨骨轉(zhuǎn)換的提高，并把軟骨組織和軟骨下骨視為一個(gè)整體，二者共同承擔(dān)外界的生物學(xué)和生物力學(xué)刺激。細(xì)胞因子可調(diào)控骨與軟骨的新陳代謝，在OA發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，滑膜與軟骨產(chǎn)生多種炎癥性細(xì)

3、胞因子如IL-1β和TNF-α，后者反過(guò)來(lái)抑制軟骨細(xì)胞的蛋白聚糖和Ⅱ膠原合成，促進(jìn)分解代謝和增加其它炎癥因子(IL-6、IL-8、PEG2和NO等)，最終導(dǎo)致基質(zhì)破壞。而對(duì)于軟骨下骨，最近研究顯示骨關(guān)節(jié)炎時(shí)伴隨有骨轉(zhuǎn)換的增強(qiáng)，早期存在破骨細(xì)胞分化和功能的加強(qiáng)。此外TGFβ1信號(hào)通路在骨關(guān)節(jié)炎的軟骨下骨硬化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，高活性的TGFβ1將促進(jìn)nestin+的MSCs聚集并向成骨分化，最終在軟骨下骨髓腔中形成大量的類(lèi)骨質(zhì)島，并伴隨有

4、血管和神經(jīng)入侵軟骨組織。
　　小G蛋白(Rho small GTPase)成員包括Racl、Cdc42和RhoA，借助GEF和GAP可在活性形式(GTP)和非活性形式(GDP)間轉(zhuǎn)換，從而作為信號(hào)傳導(dǎo)的“分子開(kāi)關(guān)”調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和其它功能。近年來(lái)已有大量研究報(bào)道顯示小G蛋白家族成員與骨發(fā)育密切相關(guān)，它們活性發(fā)生異常變化將導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)Cdc42正向調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞聚集過(guò)程，并且參與軟骨細(xì)胞的早期分化

5、。此外近年其它研究發(fā)現(xiàn)Cdc42在慢性炎癥、破骨細(xì)胞分化和功能、血管新生等過(guò)程都發(fā)揮重要作用。
　　我們通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)研究和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)揭示了Cdc42在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，并對(duì)其調(diào)控機(jī)制作了初步的探討。首先比較假手術(shù)組(Sham group)和DMM手術(shù)組(DMM group)小鼠關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的Cdc42表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)DMM組小鼠上述兩種組織內(nèi)的Cdc42表達(dá)量顯著高于Sham組。進(jìn)一步利用ITS和OBM分別

6、進(jìn)行軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示抑制活性形式的Cdc42（Cdc42-GTP）促成軟骨和抑制軟骨細(xì)胞肥大化，也能夠抑制成骨分化。此外分別用細(xì)胞因子IL-1β和TGFβ1刺激ATDC5和C3H10T1/2細(xì)胞時(shí)，Cdc42-GTP的水平顯著上升。當(dāng)ATDC5細(xì)胞中Cdc42-GTP水平上升后，將促進(jìn)ATDC5細(xì)胞中MMP13和COLX表達(dá)水平同樣顯著上升，而抑制Cdc42-GTP水平上升將減少I(mǎi)L-1β帶來(lái)的MMP13和COLX表

7、達(dá)水平的上升。同樣地，當(dāng)C3H10T1/2細(xì)胞中Cdc42-GTP水平上升后，將促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，而抑制Cdc42-GTP水平上升將抑制TGF31信號(hào)通路活性和成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)。
　　在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，我們觀察了關(guān)節(jié)局部敲降Cdc42和抑制Cdc42-GTP對(duì)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程的影響。關(guān)節(jié)組織切片的番紅O染色結(jié)果表明關(guān)節(jié)局部敲降Cdc42和抑制Cdc42-GTP能夠有效減少骨關(guān)節(jié)炎時(shí)的軟骨組織損傷。H&E染色發(fā)現(xiàn)局部敲降Cd

8、c42和抑制Cdc42-GTP能夠抑制透明軟骨層變薄和鈣化層軟骨變厚。免疫染色結(jié)果顯示局部敲降Cdc42和抑制Cdc42-GTP能夠降低骨關(guān)節(jié)炎時(shí)軟骨組織中的MMP13和COLX表達(dá)水平以及軟骨下骨中TGFβ1信號(hào)通路活性和成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因的水平。Trap染色同樣表明局部敲降Cdc42和抑制Cdc42-GTP能夠抑制破骨細(xì)胞分化和功能。此外μCT結(jié)果顯示局部敲降Cdc42和抑制Cdc42-GTP能夠改善骨關(guān)節(jié)炎時(shí)軟骨下骨的病變。

9、r>　　為了進(jìn)一步探討Cdc42如何參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，我們?cè)贏TDC5和C3H10T1/2細(xì)胞上開(kāi)展了一系列的研究。在C3H10T1/2細(xì)胞中，Western blot的結(jié)果顯示降低Cdc42-GTP和Erk磷酸化水平均抑制TGFβ1誘導(dǎo)的Erk、Smad2/3和Smad1/5磷酸化水平;免疫共沉淀的結(jié)果顯示Erk與Cdc42存在相互結(jié)合。上述結(jié)果說(shuō)明Cdc42可能通過(guò)Erk/Smads調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞聚集并向成骨分化。而在ATD

10、C5細(xì)胞中，Western blot的結(jié)果顯示降低Cdc42-GTP和Pakl活性均抑制IL-1β誘導(dǎo)的Jak/Stat3信號(hào)通路活性上升。這部分結(jié)果說(shuō)明Cdc42可能通過(guò)Jak/Stat3信號(hào)通路介入軟骨組織的炎癥反應(yīng)。動(dòng)物學(xué)上免疫染色結(jié)果同樣表明局部敲降Cdc42和抑制Cdc42-GTP能夠降低骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展時(shí)軟骨組織中Stat3以及軟骨下骨中Erk的磷酸化水平。
　　綜上所述，Cdc42介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過(guò)程，通過(guò)Jak/Sta