地衣芽胞桿菌中桿菌肽及普切明酸的合成調(diào)控研究.pdf

1、非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptides synthetases,NRPSs)和環(huán)二肽合成酶(cyclodipeptides synthetases,CDPSs)是微生物中的兩種非核糖體肽合成酶類。經(jīng)由NRPS途徑合成的桿菌肽和經(jīng)由CDPS途徑合成的普切明酸是地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)中具有代表性的非核糖體肽類抗菌物質(zhì)。但是,目前對(duì)于兩種物質(zhì)合成途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控還缺乏了解,阻礙了我們

2、對(duì)菌株的桿菌肽和普切明酸應(yīng)用潛力的挖掘。本論文以桿菌肽工業(yè)生產(chǎn)菌株B.licheniformis DW2為研究對(duì)象,通過(guò)基因重組技術(shù)、RT-qPCR、凝膠阻滯分析等方法,考察不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在桿菌肽及普切明酸合成過(guò)程中的作用,驗(yàn)證了Spo0A-AbrB-SigH調(diào)控系統(tǒng)在NRPS成途徑中的地位,并首次較完整的揭示了芽胞桿菌中CDPS合成途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究得到的主要結(jié)論如下:
　　1.Spo0A-AbrB-SigH調(diào)控系統(tǒng)對(duì)桿菌

3、肽合成的調(diào)控作用
　　bacT為假定的Ⅱ型硫酯酶基因,該基因的缺失不會(huì)影響桿菌肽合成酶操縱子bacABC的轉(zhuǎn)錄,但是會(huì)導(dǎo)致桿菌肽合成效率降低,并使桿菌肽產(chǎn)量下降83.01％,表明該假定的Ⅱ型硫酯酶(BacT)是桿菌肽合成酶系的組成部分。
　　地衣芽胞桿菌中桿菌肽合成基因的轉(zhuǎn)錄受到Spo0A-AbrB-SigH調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控。AbrB是bacT和bacABC的直接負(fù)調(diào)控因子。在abrB基因缺失或者轉(zhuǎn)錄受到抑制的菌株(DW2Δa

4、brB、DW2Δ0AΔabrB、DW2Δ0A/pHY-sad67)中,bacT和bacA基因的轉(zhuǎn)錄水平都有不同幅度的提升,單位菌體的桿菌肽產(chǎn)量相比于DW2菌株分別提升19.32％、25.60％和24.15％。在abrB基因表達(dá)量較高的菌株(DW2Δ0A、DW2Δabr B/pHY-abrB)中,bacT和bacA基因的轉(zhuǎn)錄水都被抑制,桿菌肽合成停止。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證明AbrB蛋白可以與bacT和bacA基因的啟動(dòng)子結(jié)合,表明AbrB是該基

5、因的直接負(fù)調(diào)控因子。在DW2Δ0AΔabrB菌株基礎(chǔ)上敲除sigH基因后,bacT、bacA基因的轉(zhuǎn)錄水平以及菌株的桿菌肽產(chǎn)量并未出現(xiàn)顯著變化,表明SigH沒有獨(dú)立參與桿菌肽的合成調(diào)控。
　　2.AbrB-YvnA-YvmB調(diào)控系統(tǒng)對(duì)普切明酸合成的調(diào)控作用
　　abrB基因的缺失導(dǎo)致普切明酸的合成時(shí)間提前4h,產(chǎn)量相對(duì)于DW2菌株提升103.16％,yvmC、yvnA和yvmA基因的轉(zhuǎn)錄水平不同程度上調(diào),而yvmB基因的轉(zhuǎn)錄

6、則被抑制。DW2/pHY-abrB菌株的普切明酸合成停止,yvmC、yvnA和yvmA基因的轉(zhuǎn)錄被抑制,而yvmB基因的轉(zhuǎn)錄水平上升。凝結(jié)阻滯分析證實(shí)AbrB是yvmC-cypX基因簇和yvnA基因的直接負(fù)調(diào)控因子,而對(duì)yvmA和yvmB基因?yàn)殚g接調(diào)控。DW2ΔyvmB菌株中的普切明酸產(chǎn)量相比于DW2菌株提升60.12％,yvmC和yvmA基因的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)DW2上調(diào)。DW2/pHY-yvmB菌株無(wú)法合成普切明酸,yvmC和yvmA基因

7、的轉(zhuǎn)錄也受到抑制。凝結(jié)阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí)YvmB是yvmC-cypX基因簇和yvmA基因的直接負(fù)調(diào)控因子。DW2ΔyvnA和DW2/pHY-yvnA菌株均不合成普切明酸,普切明酸合成基因簇的轉(zhuǎn)錄都受到抑制。但是在DW2ΔyvnA中yvmB基因轉(zhuǎn)錄水平上升,而在DW2/pHY-yvnA菌株中yvmB基因轉(zhuǎn)錄水平下降。在DW2ΔyvnA菌株中敲除yvmB后,菌株的桿菌肽合成能力恢復(fù)。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí),YvnA蛋白通過(guò)直接結(jié)合的方式抑制yvmC和y

8、vmB的轉(zhuǎn)錄,并間接激活yvmA的表達(dá)?？傮w而言,AbrB、YvnA和YvmB皆為普切明酸合成操縱子yvmC-cypX的負(fù)調(diào)控因子,同時(shí)AbrB也是yvnA基因的直接負(fù)調(diào)控因子,而YvnA則是yvmB基因的直接負(fù)調(diào)控因子。
　　YvmA蛋白則與普切明酸的分泌有關(guān),yvmA基因的缺失會(huì)導(dǎo)致菌株細(xì)胞內(nèi)普切明酸的積累增加。
　　3.地衣芽胞桿菌的普切明酸免疫機(jī)制
　　在各個(gè)菌株基礎(chǔ)上構(gòu)建其yvmC缺失的對(duì)照菌株,并考察各個(gè)菌