蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1520中Zwittermicin A的生物合成研究.pdf

1、ZwittermicinA(ZwA)是蘇云金芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)生的一種氨基多元醇類抗生素，化學(xué)式C13H28N6O8。它對(duì)植物的某些真菌性病原菌有抑制作用，可以增加蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白的殺蟲效率。其生物合成基因簇僅部分序列被克隆，合成途徑未知。推測(cè)認(rèn)為ZwA是以L-Ser、丙二酰輔酶A、氨基丙二酰-ACP、羥基丙二酰-ACP和2,3-二氨基丙酸(Dap)為前體物組裝而成的。本研究以產(chǎn)ZwA的蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1520為實(shí)

2、驗(yàn)材料，構(gòu)建了菌株YBT-1520的全基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)。文庫(kù)包含1536個(gè)轉(zhuǎn)化子，插入片段大小48.5-74.5kb。若菌株YBT-1520的基因組以6Mb計(jì)算，文庫(kù)共覆蓋基因組22.37倍，每1kb大小的基因出現(xiàn)幾率超過(guò)99.9％。以已經(jīng)公布的與ZwA合成相關(guān)的16kb的DNA序列為出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增篩選文庫(kù)，構(gòu)建覆蓋ZwA合成基因簇的重疊聯(lián)合群，重疊聯(lián)合群共覆蓋102kb的區(qū)域。結(jié)合末端測(cè)序和菌株YBT-152

3、0基因組測(cè)序，從而獲得蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1520ZwA生物合成基因簇。雜交結(jié)果顯示該基因簇位于菌株YBT-1520的染色體上。 基因簇大小67kb，包括30個(gè)開放閱讀框。除去已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的16kb的序列所包含的8個(gè)基因，67kb的基因簇還包含1個(gè)聚酮合成酶基因orf1和3個(gè)非核糖體肽合成酶基因orf3、orf4、orf5，合成前體物Dap的基因zwa5A、zwa5B，修飾酶氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因c，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子磷酸泛酰巰基乙胺

4、轉(zhuǎn)移酶基因zwa9，轉(zhuǎn)運(yùn)負(fù)責(zé)基因zwa7A、zwa7B。 同源性比較顯示ZWA5A和ZWA5B分別是半胱氨酸合成酶和鳥氨酸環(huán)化脫氨酶的同源物。通過(guò)同源交換插入，獲得zwa5A基因缺失突變體zwa5A。該突變體不再產(chǎn)生ZwA，用化學(xué)合成的D/L-Dap添加到突變體zwa5A。的發(fā)酵生長(zhǎng)過(guò)程中，突變體zwa5A?？梢曰謴?fù)產(chǎn)ZwA。這說(shuō)明zwa5A基因?qū)wA的產(chǎn)生是必需的；在ZwA的產(chǎn)生過(guò)程中，化合物D/L-Dap可以替代基因zwa

5、5A的功能。通過(guò)pGEX-6P-1載體，在大腸桿菌中超量表達(dá)了ZwA合成基因簇中的腺苷酰化結(jié)構(gòu)域ZWAA。依賴于ATP的焦磷酸交換實(shí)驗(yàn)表明，腺苷?；Y(jié)構(gòu)域ZWAA2可以識(shí)別并活化Dap。上述結(jié)果證實(shí)，Dap是ZwA生物合成過(guò)程中的直接前體物之一。 根據(jù)已有的假設(shè)結(jié)合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推導(dǎo)出ZwA的合成途徑：以L-Ser、丙二酰輔酶A、氨基丙二酰-ACP、羥基丙二酰-ACP和Dap為直接前體物通過(guò)非核糖體肽合成酶/聚酮合成酶/非核

6、糖體肽合成酶的雜合途徑聚合成未成熟的ZwA，然后經(jīng)氨甲?；揎椬兂沙墒斓腪wA。根據(jù)結(jié)構(gòu)與基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系，ORF1催化L-Ser非核糖體肽延伸單元的起始以及丙二酰輔酶A聚酮延伸單元的延伸，ORF2催化氨基丙二酰-ACP和羥基丙二酰-ACP兩個(gè)聚酮延伸單元的延伸，ORF3催化Dap非核糖體肽延伸單元的延伸。從L-Ser到丙二酰輔酶A是非核糖體肽到聚酮的雜合，屬于I型雜合(同一個(gè)合成酶分子內(nèi)完成雜合)，從羥基丙二酰-ACP到Dap是非核糖