一種新的造血和血管發(fā)育缺陷斑馬魚172突變體的基因鑒定與功能的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 造血過程是各種血細胞的發(fā)育、成熟的過程，是一個多階段、多步驟、受到多個因子調(diào)控涉及多個造血解剖位置的復(fù)雜而又有序的動態(tài)過程，并貫穿于生命體的一生。盡管各種血細胞組分的生理功能不同，但是它們有著同一祖先--造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)。從HSCs向成熟血細胞分化的過程中，經(jīng)歷了造血祖細胞階段和造血前體細胞階段，最終分化生成所有成熟血細胞。因此，造血過程囊括兩個含義：HS

2、Cs的生成過程和它的特化、增殖以及分化過程。盡管已有眾多相關(guān)研究報道，但是HSCs生成、特化、增殖、分化過程以及調(diào)節(jié)機制仍不甚明確。
　　 經(jīng)典的模式生物如線蟲、果蠅等與人類相距甚遠，小鼠則是公認最好的模式生物之一。然而，由于小鼠等哺乳類動物繁殖速度較慢，且體積相對較大，胚胎子宮內(nèi)發(fā)育，難以對早期造血的表型改變進行快速連續(xù)觀察，因此限制了其作為高通量化學(xué)遺傳學(xué)造血缺陷突變體的篩選與基因鑒定等方面的應(yīng)用。斑馬魚作為脊椎動物，在基因

3、組、蛋白質(zhì)組、胚胎發(fā)育以及疾病發(fā)生機制等方面均表現(xiàn)出與人類高度一致的特點。此外，斑馬魚還具有如體積小、生殖能力強、生殖周期短、體外受精、胚胎透明且生長迅速等獨特的優(yōu)勢，使其成為研究脊椎動物的胚胎、組織器官發(fā)育以及與人類疾病相關(guān)的分子遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的現(xiàn)代模式生物，尤其特別適宜于N-乙基-N-亞硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)化學(xué)誘變的大規(guī)模造血系統(tǒng)正向遺傳學(xué)突變體的篩選。并且斑馬魚心血管系統(tǒng)早期發(fā)育與人類極

4、為相似，而血液和心血管系統(tǒng)有缺陷的突變體仍然可以存活數(shù)天，為該領(lǐng)域研究提供了極為有利的條件。
　　 與哺乳動物類似，斑馬魚血細胞生成也分為原始造血(primitivehematopoiesis)和定向造血(definitive hematopoiesis)兩個階段，產(chǎn)生的分化細胞各組分與哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)成熟血細胞譜系類似。斑馬魚原始紅細胞起源于5體節(jié)時期后部側(cè)向中胚層(posterior lateral mesoderm，

5、PLM)的一對雙邊條紋，最終在20體節(jié)(somite)時期形成對應(yīng)于哺乳動物卵黃囊的中央細胞團結(jié)構(gòu)(intermediate cell mass，ICM)。這里是紅細胞進一步分化、成熟，進入血液循環(huán)，并于受精后5-7天(day post fertilization，dpf)成熟的地方。斑馬魚原始髓系細胞來源于10體節(jié)時期前部側(cè)向中胚層(anterior lateral mesoderm，ALM)，主要產(chǎn)生巨噬細胞和中性粒細胞。早期永久H

6、SCs于受精后26-30小時(hours post fertilization，hpf)在等同于哺乳動物AGM的背主動脈腹壁側(cè)(ventral wall of dorsal aorta，VDA)產(chǎn)生。隨后這些HSCs在2dpf從背主動脈腹壁側(cè)向體后血島(posterior blood island，PBI)遷移。最終造血干細胞在5dpf定居在腎臟，這是成年斑馬魚的造血器官。
　　 斑馬魚胚胎血管系統(tǒng)發(fā)育起始于6hpf原腸胚形成(

7、gastrulation)時期，此時具有雙向分化功能的血液血管母細胞在腹側(cè)中胚層分化(ventral mesoderm，VM)形成。隨后，其向中軸線遷移，在12hpf到達側(cè)向中胚層(lateral platemesoderm，LPM)，分化成為成血管細胞(angioblast)。成血管細胞約16hpf在位于內(nèi)胚層背側(cè)和脊索腹側(cè)之間的中軸線處聚集形成索樣結(jié)構(gòu)，稱為血管索(vasclar cord，VC)，從VC到成熟血管形成還需經(jīng)歷：空腔

8、管道形成(lumenformation)，動、靜脈分化選擇，血流形成以及之后的血管重塑過程中細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)連接等復(fù)雜過程。
　　 本研究通過運用化學(xué)誘變劑ENU誘變野生型AB雄性斑馬魚(FO代)，繁殖F1和F2代。待F2代長大，隨機挑選F2代一雄一雌成魚交配，收集F3代胚胎，采用整體原位雜交(whole mount in situ hybridization，WISH)的方法進行大規(guī)模遺傳學(xué)方法篩選髓系細胞標記物ly

9、sozyme C(lyC)基因缺失突變體，并詳細研究了其中一個名為172的lyC基因缺失突變體在造血過程(原始造血和永久造血)中各個譜系標記物的時空表達情況，旨在分析172基因在造血過程的作用，以期進一步明確造血過程的相關(guān)分子調(diào)控機制。同時將172突變體和一種已知早期造血過程嚴重缺陷且尚未明確基因的突變體cloche進行表型分析比較，希望深入了解兩種突變體的區(qū)別、聯(lián)系以及在造血過程的作用，為cloche基因功能的全面了解、造血過程調(diào)節(jié)機

10、制和基因定位克隆提供線索和依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容共分為四個部分：第一部分ENU突變以及造血系統(tǒng)突變體的篩選；第二部分J72突變體的正向遺傳學(xué)篩選過程；第三部分172突變體和cloche突變體表型的對比研究；第四部分造血干細胞標記物runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(runtrelated transcription factor1，runxl)基因在172突變體中功能的初步研究。
　　 第一部分 ENU突變以及造血系統(tǒng)突變體的篩選1

11、.目的：
　　 本部分將介紹斑馬魚培育和繁殖方法、ENU化學(xué)誘變以及后期大規(guī)模正向遺傳學(xué)突變體篩選，目的是篩選造血系統(tǒng)發(fā)育缺陷的斑馬魚突變體，用于后續(xù)研究工作。
　　 2.方法：
　　 采用香港科技大學(xué)溫子龍教授常規(guī)ENU突變方法誘變野生型AB雄性斑馬魚，依照本實驗室標準斑馬魚培育技術(shù)飼養(yǎng)突變后成活雄魚(F0代)，并繁殖到F2代。隨機挑選一雄一雌F2代魚交配，收集所產(chǎn)胚胎，于胚胎發(fā)育36hpf時期以髓系細胞標記物

12、lyC為探針，應(yīng)用WISH技術(shù)篩選lyC基因表達缺失突變體。
　　 3.結(jié)果：
　　 ENU突變后F0代總共12-15條魚存活，其與野生型AB交配產(chǎn)下F1子代1200條，最終進行大規(guī)模正向遺傳學(xué)造血缺失突變體篩選時，收集F3代36hpf時期的胚胎，應(yīng)用lyC為探針進行WISH，總共篩選到4個斑馬魚lyC缺失突變體。
　　 第二部分172突變體的正向遺傳學(xué)篩選1.目的：
　　 根據(jù)第_部分敘述，本研究在EN

13、U突變基礎(chǔ)上，以髓系造血細胞標記物lyC為探針，篩選到4個lyC缺失突變體。本章節(jié)詳述其中一個名為172的突變體篩選過程，目的是了解篩選的具體策略以及初步了解172突變體表型，為深入分析172突變體提供線索和依據(jù)。
　　 2.方法：
　　 首先，采用分子生物學(xué)實驗技術(shù)方法制備原位雜交RNA探針；其次，運用斑馬魚WISH技術(shù)檢測lyC基因表達；之后，運用遺傳學(xué)實驗方法進行互補實驗，將172突變體和cloche突變體交配，觀

14、察子代是否出現(xiàn)cloche突變體表型；最后，采用O-dianisidine染色實驗(氧化還原反應(yīng))檢測互補實驗中胚胎3dpf時期的血紅蛋白定位，以間接說明紅細胞定位，明確172突變體表型。
　　 3.結(jié)果：
　　 WISH實驗說明：36hpf時期172純合突變體大體形態(tài)同野生型相比沒有差別，但是約有近1/4的胚胎(突變體數(shù)目/總體胚胎數(shù)目=36/152)lyC基因表達缺失。觀察172純合突變體大體形態(tài)發(fā)現(xiàn)：在出生1天前沒

15、有明顯的形態(tài)學(xué)的改變，而在1-2dpf開始約有近1/4的胚胎(突變體數(shù)目/總體胚胎數(shù)目=43/167)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化，形態(tài)學(xué)改變?nèi)缦拢?)沒有血液循環(huán)，但3dpf時期可以看見紅細胞在VDA區(qū)域聚集；2)心臟逐漸腫大，心跳較慢，并被異常拉伸成管狀；3)頭較小，體長短；4)大約可以存活5-6天?；パa實驗結(jié)果表明：172(+/-)與cloche(+/-)交配產(chǎn)下的胚胎中，約有近1/4的胚胎(突變體數(shù)目/總體胚胎數(shù)目=61/233)逐漸出現(xiàn)與c

16、loche純合突變體較一致的表型，但是3dpf時期在VDA有聚集的紅細胞。O-dianisidine染色實驗提示：3dpf時期胚胎血紅蛋白主要富集在VDA區(qū)域。同時檢測21s時期172純合突變體和cloche純合突變體中珠蛋白亞基βe1基因表達，結(jié)果顯示約有近1/4的胚胎(突變體數(shù)目/總體胚胎數(shù)目=35/148)的胚胎，即172純合突變體，其珠蛋白亞基βe1基因mRNA表達減少；而約有近1/4的胚胎(突變體數(shù)目/總體胚胎數(shù)目=32/13

17、6)即cloche純合突變體，其表達顯著減少。
　　 第三部分172突變體和cloche突變體表型的對比研究1.目的：
　　 本部分重點進行了造血過程中172突變體各個譜系表型的研究，以及分析其與cloche突變體區(qū)別和聯(lián)系，目的是全面了解172基因在造血過程中的功能，同時明確其與cloche基因是否具有相同或者相似的功能。另外，cloche突變體在早期血管發(fā)育方面也存在嚴重缺陷，為了明確172在血管發(fā)育方面是否存在缺陷

18、，我們也簡單對血管內(nèi)皮標記物flk1基因的表達情況，目的是確定172基因在血管發(fā)育方面的作用。
　　 2.方法：
　　 主要通過采取整體原位雜交技術(shù)，針對172突變體和cloche突變體在造血過程中發(fā)育的各個階段(原始造血和永久造血階段)各個譜系(紅系、髓系、淋巴系和干細胞)進行了詳細的表型研究，同時運用O-dianisidine染色實驗(氧化還原反應(yīng))檢測3dpf時期172突變體和cloche突變體中的血紅蛋白定位，以

19、間接證實紅細胞在兩種突變體中的區(qū)別定位。
　　 3.結(jié)果：
　　 1)收集172雜合突變體自交和cloche雜合突變體自交各個發(fā)育階段的胚胎用于WISH實驗，突變體胚胎數(shù)目與用檢測胚胎總數(shù)均近似為1/4，符合孟德爾遺傳規(guī)律(詳見表3-1)。
　　 2)早期造血階段scl基因表達和原始造血階段各個譜系標記物時空表達(1)紅系：檢測了10s、1dpf、36hpf時期的野生型、172純合突變體和cloche純合突變體的

20、珠蛋白(globin)亞基βe1基因在mRNA水平表達情況。10s時期野生型胚胎βe1基因在ALM區(qū)域(兩條條紋)表達，1dpf時期在ICM區(qū)域表達，36hpf在VDA區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，172純合突變體的珠蛋白亞基βe1基因mRNA表達水平在各個時期均稍有減少，而cloche突變體βe1基因mRNA表達水平在各個時期均顯著減少。隨后，進一步檢測了10s、1dpf、36hpf時期野生型、172純合突變體和cloche純合突

21、變體早期紅系發(fā)育轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子gata1基因在mRNA水平表達情況。10s時期野生型胚胎βe1基因在ALM區(qū)域(兩條條紋)表達，1dpf時期在ICM區(qū)域表達，36hpf在VDA區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，172純合突變體的gata1基因mRNA表達水平在各個時期均稍有減少，而cloche純合突變體gata1基因mRNA表達水平在各個時期顯著減少。
　　 (2)髓系：檢測了1dpf、36hpf時期的野生型、172純合突變體和c

22、loche純合突變體的髓系表面標記物lyC、l-plastin和mpo基因mRNA水平表達情況。ldpf時期野生型胚胎lyC、l-plastin和mpo基因均在卵黃囊前部和尾部區(qū)域表達，36hpf時期主要在VDA區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，1dpf時期172純合突變體和cloche純合突變體的lyC基因mRNA表達缺失，1dpf、36hpf時期172純合突變體和cloche純合突變體的，l-plastin基因mRNA表達缺失，而1

23、dpf、36hpf時期172純合突變體的mpo基因mRNA表達顯著減少。隨后，檢測了21s時期的野生型、172純合突變體和cloche純合突變體的早期髓系表面標記物pu.1基因mRNA水平表達情況。21s時期野生型pu.1基因在“卵黃囊前部”區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，21s時期172純合突變體和cloche純合突變體的pu.1基因mRNA表達均缺失。
　　 (3)早期造血調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子scl基因：檢測了10s、21s時期早

24、期調(diào)節(jié)造血調(diào)節(jié)因子scl基因在野生型、172純合突變體和cloche純合突變體mRNA水平的表達情況。10s時期野生型胚胎scl基因在與同時期野生型胚胎相比，10s時期早期調(diào)節(jié)造血調(diào)節(jié)因子scl基因3’prime探針(scl-a和/或-β亞型)在ALM和PLM區(qū)域均有表達，5’prime探針(scl-α亞型)在PLM區(qū)域表達；而21s時期scl基因3'prime探針(scl-α和/或-β亞型)在ALM、ALPM和ICM區(qū)域均有表達，5'

25、prime探針(scl-α亞型)在ICM區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，172純合突變體scl基因(3’prime探針和5’prime探針)表達減少，而cloche純合突變體scl基因(3’prime探針和5’prime探針)mRNA均表達缺失。
　　 3)永久造血階段各個譜系標記物時空表達(1)紅系：檢測了3dpf，4dpf時期的野生型、172純合突變體和cloche純合突變體的珠蛋白亞基βel基因mRNA水平的表達情況。3

26、dpf、4dpf時期野生型胚胎βel基因主要在PBI區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，172純合突變體的βel基因主要在富集在VDA區(qū)域，且表達水平與同時期野生型表達水平無明顯區(qū)別，cloche突變體βel基因在PBI表達減少。隨后，進一步運用血紅蛋白染色(O-dianisidine染色)方法，檢測了3dpf時期172突變體和cloche突變體血紅蛋白定位。3dpf時期野生型胚胎，血紅蛋白除在血液循環(huán)中主要定位于PBI區(qū)域。與同時期野生

27、型胚胎相比，172突變體血紅蛋白定位在VDA區(qū)域，表達量無顯著差異，而cloche主要定位在PBI，但是表達量減少。
　　 (2)髓系：檢測了3dpf、4dpf時期的野生型、172純合突變體cloche純合突變體的髓系細胞表面標記物lyC、l-plastin和mpo基因mRNA水平的表達情況。3dpf時期和4dpf時期野生型胚胎lyC、l-plastin和mpo基因在PBI區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，172純合突變體的ly

28、C、l-plastin和mpo基因表達在VDA區(qū)域，且表達水平與野生型表達無明顯區(qū)別；而cloche純合突變體lyC、l-plastin和mpo基因表達缺失。
　　 (3)淋巴系：檢測了4dpf時期的野生型、172純合突變體和cloche突變體的T淋巴細胞表面標記物rag1基因mRNA水平的表達情況。4dpf時期的野生型rag1基因在胸腺表達。與同時期野生型胚胎相比，4dpf時期172純合突變體和cloche純合突變體的rag1

29、基因表達缺失。
　　 (4)HSCs標記物：檢測了36hpf、3dpf、5dpf時期的野生型、172純合突變體和cloche純合突變體中HSCs表面標記物c-myb基因mRNA水平的表達情況。36hpf時期野生型胚胎c-myb基因在VDA區(qū)域表達，3dpf和4dpf時期c-myb基因主要在PBI區(qū)域表達。36hpf時期172純合突變體c-myb基因在VDA區(qū)域有少量表達，3dpf、5dpf時期172純合突變體的c-myb基因依然

30、在VDA區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，36hpf時期172純合突變體c-myb基因mRN，A表達顯著減少，3dpf、5dpf時期172純合突變體的c-myb基因表達減少，但是減少的程度不及36hpf時期；而36hpf、3dpf、5dpf時期cloche純合突變體c-myb基因表達缺失。同時，還檢測36hpf時期的野生型、172純合突變體和cloche純合突變體的HSCs另一個表面標記物runx1基因mRNA水平的表達情況。36hpf

31、時期野生型胚胎runx1基因在VDA區(qū)域表達。與同時期野生型胚胎相比，36hpf時期172純合突變體和cloche純合突變體runx1基因表達缺失。
　　 4)血管內(nèi)皮標記物flk1時空表達情況檢測了21s、1dpf和2dpf時期的野生型、172純合突變體和cloche純合突變體中血管標記物flk1基因mRNA水平的表達情況。21s時期野生型胚胎flk1基因在背主動脈(dorsal aorta，DA)和后部尾靜脈(posteri

32、or cardinal vein，PCV)表達，1dpf時期ISV開始表達，2dpf時期背部縱向吻合血管(dorsal longitudinalanastomotic vessels，DLAV)開始表達。與同時期野生型胚胎，172突變體flk1表達較少，血管內(nèi)皮可以生成但是無法連接形成管道，而cloche突變體僅在尾部有表達，在其它血管表達缺失。
　　 第四部分造血干細胞標記物runx1基因在J72突變體中功能的初步研究1.目的

33、：
　　 永久造血過程中172突變體中有紅細胞和髓系細胞在VDA區(qū)域富集，但是尚不清楚這些細胞是否是永久造血過程產(chǎn)生。為此，設(shè)計實驗來證實這些細胞來源以及明確造血干細胞標記物runx1基因在172突變體中的作用。
　　 2.方法：
　　 將172雜合突變體(+/-)和runx1純合突變體(-/-)雜交，飼養(yǎng)下一代，待其發(fā)育成熟篩選出172基因和runx1基因都為雜合突變體，即172(+/-)runx1(+/-)。

34、隨機挑選一雄一雌，收集3dpf時期胚胎，利用runx1基因型檢測方法和整體原位雜交技術(shù)，將基因型和表型一一對應(yīng)，分析細胞來源。
　　 4.結(jié)果：
　　 1)基因型檢測為172基因缺失runx1基因雜合突變體，即172(-/-)runx1(+/-)突變體lyC表達量減少；
　　 2)基因型檢測為172基因和runx1基因都缺失，即172(-/-)runx1(-/-)突變體lyC表達缺失；
　　 3)基因型檢

35、測runx1純合突變體，即runx1(-/-)突變體lyC表達顯著減少；
　　 4)基因型檢測runx1雜合突變體，即runx1(+/-)突變體沒有表型。
　　 全文結(jié)論：
　　 1)化學(xué)誘變劑ENU可以成功的誘變斑馬魚AB品系雄魚，并且髓系血細胞標記物lyC用于原始造血階段髓系發(fā)育缺陷的突變體篩選工作是可靠的。
　　 2)篩選到的lyC缺失突變體172大體形態(tài)改變與cloche突變體基本一致，互補實驗提

36、示：172基因可能與cloche基因為同一基因，而172突變體或許是這個基因上一個新的點突變的突變體(新的等位基因點突變的突變體)。
　　 3)172突變體在原始造血階段紅系造血缺陷不顯著，而髓系造血過程嚴重障礙，并且早期造血階段也存在部分缺陷；永久造血階段172突變體紅系髓系造血缺陷并不顯著，而且髓系細胞似乎有“恢復(fù)”現(xiàn)象，T淋巴細胞標記物rag1基因表達缺失，提示淋巴系造血過程障礙；HSCs標記物早期表達減少，隨著時間的推移

37、HSCs出現(xiàn)，提示HSCs早期發(fā)育異常。clcohe突變體則表現(xiàn)為造血過程中所有譜系造血嚴重缺陷。因此推測172突變體可能是一種表現(xiàn)出“較弱表型”的cloche突變體。
　　 4)172突變體血管內(nèi)皮生成減少，并且不能連通形成管道，而cloche突變體血管內(nèi)皮細胞除在尾部表達之外，其它血管內(nèi)皮和心內(nèi)膜均表達缺失。
　　 5)runx1基因是在永久造血過程中172突變體髓系細胞生成所必需的基因，runx1基因和172基因在