應(yīng)用TALEN技術(shù)敲除斑馬魚IDH基因及突變體篩選.pdf

1、異檸檬酸脫氫酶(IDH)是三羧酸循環(huán)中異檸檬酸被催化生成α-酮戊二酸的限速酶。
　　idh1基因位于斑馬魚9號(hào)染色體上，在ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本idh1-201和idh1-202。idh1-201含有9個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度1995bp，編碼429個(gè)氨基酸。idh1-202含有10個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度1977bp，編碼423個(gè)氨基酸。idh2基因位于斑馬魚18號(hào)染色體上，在ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本idh2-2

2、01和idh2-202。idh2-201有24個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度1650bp，編碼450個(gè)氨基酸。idh2-202有16個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度1641bp，編碼447個(gè)氨基酸。idh3基因位于斑馬魚23號(hào)染色體上，在ensembl有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本idh3-201，idh3-003和idh3-001。idh3-201有13個(gè)外顯子組成，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度2475bp，編碼391個(gè)氨基酸，idh3-003有14個(gè)外顯子組成，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度2470bp，編碼

3、391個(gè)氨基酸，idh3-001有5個(gè)外顯子組成，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度1565bp，編碼66個(gè)氨基酸。
　　IDH3由2個(gè)α亞基，一個(gè)β亞基和一個(gè)γ亞基組成了異源四聚體，在癌變過程中IDH3起了關(guān)鍵性的作用。但是在造血方面暫時(shí)還沒有idh3基因發(fā)生突變的報(bào)道，因此在此文中idh3基因不是我們研究的重點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)生了idh1和idh2基因的突變，并且在骨髓增生異常綜合征(MDS)、骨髓及外骨髓增生腫瘤(MPN)、慢性髓單核

4、細(xì)胞白血病(CMML)、急性髓系細(xì)胞白血病(AML)和淋巴腫瘤中也檢測(cè)到IDH發(fā)生了突變。idh1和idh2基因一般發(fā)生雜合突變，在血液疾病中IDH發(fā)生最常見的突變是單個(gè)氨基酸的突變。在大部分病人中發(fā)現(xiàn)IDH1蛋白發(fā)生的突變位點(diǎn)常常在翻譯生成的肽鏈序列的第132號(hào)位點(diǎn)發(fā)生，132號(hào)位點(diǎn)的精氨酸突變成了組氨酸(R132H)，IDH1蛋白發(fā)生正常作用時(shí)形成的是同源二聚體，產(chǎn)生的α-酮戊二酸被PHD所利用，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)發(fā)生

5、加羥基作用，隨后發(fā)生降解，在腫瘤細(xì)胞中IDH1蛋白一個(gè)亞基發(fā)生突變，形成了無正常功能的蛋白，缺氧誘導(dǎo)因子不能產(chǎn)生加羥基作用，不能發(fā)生降解，隨后誘導(dǎo)一些腫瘤相關(guān)的因子產(chǎn)生，像葡萄糖運(yùn)輸因子1(Glut1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、磷酸甘油酸激酶(PGK1)，這些因子促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生大量增殖，這也提示idh1基因更可能的功能是腫瘤抑制基因而不是原癌基因。
　　IDH2則是在翻譯生成的蛋白序列第140個(gè)氨基酸和第172個(gè)氨基酸發(fā)生

6、突變，140號(hào)位的精氨酸突變生成了谷氨酰胺(R140Q)，172號(hào)位的精氨酸突變生成了賴氨酸(R172K)。突變的IDH1/2導(dǎo)致異檸檬酸生成α-酮戊二酸的過程發(fā)生了阻礙，正常的α-酮戊二酸生成量降低，轉(zhuǎn)而生成了大量的不正常產(chǎn)物D-二羥基戊二酸。因此二羥基戊二酸可以作為檢測(cè)IDH1/2突變導(dǎo)致的血液疾病標(biāo)記物。
　　除了IDH1/2突變直接影響外，該基因還通過影響某些基因的甲基化，引起特定通路中相關(guān)基因的表達(dá)或抑制間接引起疾病。體

7、外實(shí)驗(yàn)中，IDH1/2突變體白細(xì)胞表達(dá)增多，這癥狀與tet2缺失導(dǎo)致的干細(xì)胞標(biāo)志物增多和髓系細(xì)胞分化減少是一致的。IDH1/2突變使tet2的功能受影響，從而影響tet2維持和造血相關(guān)的基因的甲基化。IDH1/2突變的小鼠表現(xiàn)出5hmC水平的大量降低。這個(gè)現(xiàn)象說明D-二羥基戊二酸生成抑制了tet2蛋白的活性。正常細(xì)胞中IDH1/2催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，tet2在α-酮戊二酸的作用下招募DNA去甲基化酶使某個(gè)基因啟動(dòng)子位點(diǎn)發(fā)生去甲

8、基化作用，DNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的因子便結(jié)合在該位點(diǎn)，引起基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使基因行使表達(dá)功能。當(dāng)IDH發(fā)生突變，生成了D-二羥基戊二酸，這個(gè)時(shí)候tet2便不能招募DNA去甲基化酶，基因啟動(dòng)子位點(diǎn)的DNA甲基化酶占有主導(dǎo)地位，使該位點(diǎn)持續(xù)甲基化，這個(gè)時(shí)候基因便不能轉(zhuǎn)錄，即不能表達(dá)出功能，使基因發(fā)生沉默。假如該基因是維持生命活動(dòng)的重要基因，便會(huì)使人產(chǎn)生疾病。
　　通過比對(duì)人、小鼠、斑馬魚的IDH1/2基因，我們可以看到它們的基因還是相當(dāng)保守的，

9、比如說IDH1蛋白肽鏈132位點(diǎn)，IDH2蛋白肽鏈的140和172位點(diǎn)。大量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、敲除小鼠IDH1和IDH2保守位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)以及一些血液疾病的臨床病人樣本檢測(cè)都發(fā)現(xiàn)IDH1/2突變是導(dǎo)致造血異常的一種致癌基因。但是還沒有一個(gè)好的模型能夠來研究idh1/2基因突變導(dǎo)致的血液疾病，斑馬魚由于自身的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)，能夠很好的回答idh1/2基因突變?cè)斐傻脑煅惓＃虼吮挥脕硌芯垦杭膊?。這篇文章主要想通過Talen的方法敲除斑馬魚中的idh1和

10、idh2基因，篩選出突變的斑馬魚，檢測(cè)造血的淋系，髓系，紅系等各個(gè)譜系，建立造血異常的斑馬魚突變疾病模型。
　　基因敲除是證明基因功能不可缺少的邏輯環(huán)節(jié)，是基因工程和基因治療的重要手段，常見的基因敲除方法有自殺質(zhì)粒，RNAi，ZFN（鋅指核酸酶），但是自殺質(zhì)粒這種敲除方法同源重組幾率低，操作難度大，RNAi是一種臨時(shí)性的敲除方法，不能穩(wěn)定遺傳下去。ZFN設(shè)計(jì)依賴上下游序列、脫靶率高、具有細(xì)胞毒性，且只能在體外操作，再輸回病人體內(nèi)，

11、操作復(fù)雜，容易引起免疫反應(yīng)，因此難以推廣使用。這個(gè)時(shí)候我們就需要一種新的敲除方法，Talen敲除方法就避免了以上幾種敲除方法的缺點(diǎn)。該方法基于Talen(transcription activator-like(TAL) effector nucleases）靶向基因敲除，原理是Talen真核表達(dá)載體表達(dá)一個(gè)重組核酸酶，在靶點(diǎn)識(shí)別結(jié)構(gòu)域的作用下，識(shí)別靶點(diǎn)核酸序列，核酸酶發(fā)揮內(nèi)切酶活性，打斷目的基因，觸發(fā)DNA同源重組或非同源末端連接，重

12、組過程中發(fā)生修復(fù)錯(cuò)誤就導(dǎo)致了基因發(fā)生突變，從而達(dá)到基因敲除的目的。
　　1989年，植物病原體黃單胞菌屬（Xanthomonas spp.）avrBs3基因被克隆，2007年發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性，avrBs3-TA，2009年XanthomonasTA氨基酸序列與核酸靶序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系被破譯:由34個(gè)aa重復(fù)序列組成一個(gè)單元，重復(fù)17-18次;34個(gè)氨基酸中的第12和13個(gè)氨基酸(Repeat Variant Di-resi

13、due，RVD)對(duì)應(yīng)識(shí)別一個(gè)目標(biāo)堿基。RVD與堿基A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G，欲使Talen特異識(shí)別某一核酸序列，只須按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng)TAL單元（14-18個(gè)）串聯(lián)克隆即可。
　　Talen基因敲除基本步驟主要包括:1.確定靶點(diǎn):選擇目標(biāo)基因外顯子中相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點(diǎn);2.TAL靶點(diǎn)識(shí)別域的克隆構(gòu)建;3.將TAL靶點(diǎn)識(shí)別域克隆入特定的真核表達(dá)載

14、體;4.將重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄生成的mRNA顯微注射進(jìn)斑馬魚單細(xì)胞受精卵中以表達(dá)重組核酸酶，敲除基因;5.篩選突變體。目前TALEN系統(tǒng)利用Fok1的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。因Fok1需形成二聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14-18個(gè)堿基）分別進(jìn)行TAL識(shí)別模塊構(gòu)建。當(dāng)構(gòu)建好的Talen表達(dá)載體注射入斑馬魚的胚胎中，下一步我們要做的就是檢測(cè)敲除效率，篩選出突變體。我們可以利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)

15、挑選的，位于相鄰靶位點(diǎn)之間的特異性內(nèi)切酶位點(diǎn)，進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切鑒定以篩選發(fā)生目標(biāo)基因敲除的突變個(gè)體。當(dāng)左右靶點(diǎn)之間沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)可使用CEL-Ⅰ核酸酶檢測(cè)。由于通過單元組裝法能夠構(gòu)建任何序列的識(shí)別蛋白，因此從理論上來說TALEN技術(shù)可以敲除任何基因。
　　本文通過TALEN技術(shù)敲除異檸檬酸脫氫酶基因，獲得該基因突變的斑馬魚，初步探討不同突變類型的斑馬魚突變體是否能夠?qū)е履承┰煅矫娴谋硇统霈F(xiàn)。本文分為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)

16、果與分析，討論及全文總結(jié)，展望5部分。
　　目的:
　　通過人工構(gòu)建Talen靶向敲除載體敲除idh1/2基因，篩選出突變體，并進(jìn)行一些造血方面相關(guān)譜系表型鑒定。
　　方法:
　　采用單元組裝法構(gòu)建靶向敲除idh1/2基因的載體，通過試劑盒在體外轉(zhuǎn)錄成Talen mRNAs，通過顯微注射方法注入單細(xì)胞時(shí)期的受精卵中，胚胎期檢測(cè)Talen敲除效率，再通過剪尾、PCR、酶切、測(cè)序篩選出發(fā)生基因突變的成年斑馬魚及突變的

17、類型，然后通過斑馬魚胚胎整體原位雜交，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，吉姆薩染色，蘇丹黑B染色鑒定突變的斑馬魚造血相關(guān)表型。
　　結(jié)果:
　　構(gòu)建完成的TALEN載體，PCR及酶切發(fā)現(xiàn)插入了組裝的TALE序列。顯微注射進(jìn)斑馬魚胚胎中，檢測(cè)效率達(dá)到預(yù)期。將敲除有效率的斑馬魚養(yǎng)大，剪尾，提DNA，PCR酶切跑膠，測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了idh1/2突變的斑馬魚，并且在各種突變類型的斑馬魚中暫時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)與造血相關(guān)表型出現(xiàn)，猜想idh1/2基因突變導(dǎo)

18、致的造血異?？赡苁嵌喾N基因相互作用結(jié)果，需要進(jìn)一步找到與idh1/2基因相互作用的基因。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建idh1/2基因敲除的斑馬魚動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究人類idh1/2基因突變引起的血液疾病發(fā)病機(jī)制提供了良好的動(dòng)物模型。由于造血作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，想完全弄明白還是一個(gè)具有挑戰(zhàn)的事情，我們只能初步模擬idh1/2基因在人類中目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與造血相關(guān)的突變位點(diǎn)，期望弄清楚idh1/2突變導(dǎo)致血液疾病如白血病的機(jī)制。