煙草NtCIPK23基因的克隆、表達(dá)分析及轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)研究.pdf

1、鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白的互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)是作為下游蛋白與活化的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白CBL(Calcineurin B-like proteins)相互作用的一類蛋白。二者的相互作用能將植物Ca2+信號傳遞下去，而Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使在植物對抗各種非生物脅迫的防御機(jī)制中起著重要的作用。
　　 研究表明，CIPK基因家族蛋白廣泛參與植物的逆境脅迫應(yīng)答和生長

2、發(fā)育調(diào)控，非生物脅迫(Abiotic stresses)因子如干旱、高鹽和低鉀等都能引起植物CIPK基因的上調(diào)表達(dá)，其中擬南芥CIPK23基因蛋白在鉀離子代謝中有重要作用。目前，對CIPK基因功能的研究主要集中在擬南芥和水稻中，最近幾年，隨著大規(guī)模植物基因組測序的完成，在楊樹、豌豆和苜蓿等植物中對CIPK基因的研究也越來越深入。煙草是一種重要的模式植物與農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，對煙草CIPK基因的研究無論是在基礎(chǔ)理論研究領(lǐng)域，還是在通過遺傳育種指

3、導(dǎo)生產(chǎn)實踐領(lǐng)域都具有積極的意義。本研究從煙草中克隆獲得一個新的CIPK基因，命名為NtCIPK23。通過基因序列結(jié)構(gòu)分析、逆境脅迫的表達(dá)特征檢測和轉(zhuǎn)基因過表達(dá)分析，對NtCIPK23的功能進(jìn)行了初步的探索。主要工作如下：
　　 ①結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，克隆獲得NtCIPK23基因orf編碼區(qū)序列，總長度1350bp，GC含量為42.13％，與蓖麻、楊樹的部分CIPK基因序列相似度在80％以上。NtCIPK23基因編碼450個氨

4、基酸殘基，預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量為50.702 kD，等電點(diǎn)為9.18，親水性的總平均值為-0.3751。比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NtCIPK23對應(yīng)的蛋白序列在N端蛋白激活結(jié)構(gòu)域和C端NAF結(jié)構(gòu)域比較保守。
　　 ②半定量RT-PCR分析表明，NtCIPK23基因在轉(zhuǎn)錄水平受干旱脅迫強(qiáng)烈的誘導(dǎo)。在高鹽和SA的脅迫下，NtCIPK23的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，表明NtCIPK23也受這兩種脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。但是在冷脅迫下，NtCIP

5、K23并沒有表現(xiàn)出明顯的受誘導(dǎo)表達(dá)模式。
　　 ③為進(jìn)一步的探索NtCIPK23的功能，本研究將NtCIPK23構(gòu)建到植物超表達(dá)TA克隆載體pCXSN中，構(gòu)建成CaMV35S啟動子驅(qū)動的雙元載體pCXSN-35S：NtCIPK23。通過電轉(zhuǎn)化的方法，將該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌LBA4404中，并通過質(zhì)粒PCR以及測序證實獲得陽性克隆。采用葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，經(jīng)抗性篩選、TAIL-PCR和半定量RT-PCR鑒定證實獲得轉(zhuǎn)基因