青稞差減cDNA文庫的構建及冷誘導基因的克隆和轉基因煙草表達研究.pdf

1、溫度是限制植物地域分布的一個主要因素，大多數(shù)植物在低溫下一般會遭到不同程度的傷害，全球每年由于低溫凍害造成的作物損失巨大。因此，研究并提高植物的抗寒性具有重要的理論和現(xiàn)實意義。 近年來，由于生物技術的發(fā)展和廣泛應用，大量與抗寒相關的基因被分離和鑒定出來，并證明其中部分基因對提高植物的抗寒性有一定作用。同時，初步提出了低溫信號轉導以及調控路徑的模型，從而為采用基因工程手段進行植物抗寒育種及有關生理研究提供了新的啟示。 青稞

2、，又稱裸大麥，是一種禾本科作物，主要分布于青藏高原地區(qū)。與其他禾本科作物相比，青稞對極端環(huán)境脅迫，尤其是對低溫脅迫的抵抗能力較強，是一個潛在的遺傳資源庫，研究并開發(fā)這些抗低溫相關基因及其調控機制將具有十分重要的理論和實踐意義。為此，本文以青稞作為實驗材料，在建立起其組織培養(yǎng)離體再生體系的基礎上，對其冷誘導相關基因進行了研究，結果如下： Ⅰ．以青稞成熟胚為外植體，對外植體作兩種處理：(1)成熟胚外帶部分胚乳(E)；(2)成熟胚不帶

3、胚乳(NE)。兩種成熟胚均接種在含不同濃度2，4-D(1～5 mg/L)的MS培養(yǎng)基上。暗培養(yǎng)7 d后，白色疏松的愈傷組織出現(xiàn)，同時，在外植體E中部分胚直接長出芽，胚的發(fā)芽率隨2，4-D濃度的升高呈下降趨勢。在兩種外植體中，愈傷組織誘導率存在一定差異。外植體NE產生的愈傷組織明顯高于外植體E，在2，4-D濃度為3 mg/L時，其誘導率可達93.1％。愈傷組織在含2 mg/L 2，4-D的激素條件下繼代培養(yǎng)1代后轉入含不同濃度6-BA(1

4、～5mg/L)和500 mg/L CH的MS培養(yǎng)基上，21 d后愈傷組織表面開始出現(xiàn)綠色芽點。與愈傷組織誘導相反，來源于外植體E的愈傷組織的分化率高于外植體NE的愈傷組織，在含2 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，計有65.2％的愈傷組織可分化出苗。轉入1/2 MS培養(yǎng)基上則可誘導出根。研究建立了青稞成熟胚離體誘導再生植株的實驗體系。 Ⅱ．采用PCR法從青稞中克隆了hblt14.2基因，與大麥的blt14.2基因具有98.9％的同源

5、性，在蛋白質上存在2個氨基酸的差別。hblt14.2基因共有470個核苷酸，其中包括249 bp的開放閱讀框，69 bp的5 非翻譯區(qū)和152 bp的3非翻譯區(qū)。該基因編碼一個82個氨基酸的蛋白質，分子量為7.71 kDa，等電點為7.03。氨基酸組成表明，該蛋白富含Gly(17.07％)、Ala(15.85％)、Leu(13.41％)和Val(9.76％)氨基酸，是一種高度親水的小分子蛋白。hblt14.2蛋白二級結構主要以豐富的α-

6、螺旋和無規(guī)則卷曲為主，與其他冷誘導基因在氨基酸組成和二級結構上具有相似性。采用RT-PCR方法研究了青稞力hblt14.2基因在低溫、鹽脅迫以及ABA處理下的轉錄水平變化。結果表明，只在4℃低溫處理下的幼苗中檢測到了hblt14.2基因的表達，而在鹽脅迫和ABA處理的幼苗中未檢測到，推測hblt14.2基因為一個專一低溫誘導基因。此外，RT-PCR分析顯示，hblt14.2基因的表達可能具有組織特異性，它在葉片中的表達量很高，但在根中未

7、檢測到該基因的表達。 將hblt14.2基因連上強啟動子CaMV35S和終止子后定向插入質粒pCAMBIAl30l的多克隆位點中，構建了植物表達載體pCAMBIA-BI-hblt。通過根癌農桿菌LBA4404介導，將連有啟動子和終止子的目的基因轉入普通煙草。PCR和Southern檢測表明，目的基因已整合到煙草基因組中。RT-PCR檢測表明，目的基因在轉基因煙草中獲得了轉錄水平上的表達。 采用酶法分離了轉基因煙草及其對照

8、植株的葉肉原生質體，在相同條件下作低溫脅迫培養(yǎng)。結果表明，轉基因煙草原生質體存活率略高于對照植株，低溫脅迫35 d后，轉基因植株原生質體存活率為56.7％，而對照植株為43.2％。低溫處理1 w后，在轉基因植株的原生質體中出現(xiàn)了1次細胞分裂，而在對照植株中未出現(xiàn)。此外，對低溫脅迫下轉基因煙草及其對照植株的葉片脯氨酸含量進行了測定。結果表明，轉基因煙草中的脯氨酸含量低于對照植株。在低溫處理72 h后，對照葉片中脯氨酸含量為1.22 mg/

9、g，而轉基因煙草中只有0.57 mg/g。分析認為，可能是hblt14.2基因在煙草中的高效表達，在一定程度上提高了植株對低溫的抵抗力，從而使另一條抗低溫代謝途徑--脯氨酸合成途徑被削弱。由上述結果推測，青稞hblt14.2基因與植物的抗寒性有一定關系。 Ⅲ.以4℃低溫處理的幼苗為實驗方(Tester)，室溫生長的幼苗為驅動方(Driver)，通過抑制差減雜交(SSH)技術構建了包含240個單克隆的青稞差減cDNA文庫。從文庫中

10、隨機取出32個克隆進行雙酶切檢測，結果表明87.5％的克隆中含有插入片段。對其中16個克隆進行測序，獲得12個不重復cDNA序列，片段平均大小為452 bp。序列比對顯示，這些片段與其他植物的下列基因具有一定的同源性：金屬硫蛋白、蛋白激酶、乙烯信號轉錄因子、bzip轉錄因子、鋅指轉錄因子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶、富含亮氨酸蛋白、果糖二磷酸酶、銅鋅超氧化物岐化酶、核糖體蛋白、鈉氫逆向轉運蛋白、過氧化氫酶、NADPH-細胞色素還原酶、抗