徐淮山羊PPARγ基因的克隆表達(dá)及轉(zhuǎn)基因綿羊制備的初步研究.pdf

1、過(guò)氧化氫酶體激活增殖受體(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子。研究表明PPARs分為三種亞型,即PPARα、β、γ。PPARγ在動(dòng)物脂肪代謝調(diào)控方面的生物學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)為,促進(jìn)脂肪細(xì)胞早期分化和脂質(zhì)正向代謝調(diào)節(jié)。它對(duì)脂質(zhì)代謝幾種基因表達(dá)的調(diào)控,最終會(huì)導(dǎo)致甘油三酯的清除增加,刺激細(xì)胞攝取脂肪酸、甘油三酯和極低密度脂蛋白的產(chǎn)生,提高高密度蛋白,因而它是體

2、內(nèi)脂質(zhì)平衡的生理傳感器,在維持體內(nèi)脂質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)平衡中起到樞紐作用。目前,對(duì)于該基因的研究主要集中在人、小鼠等動(dòng)物的脂類代謝疾病問(wèn)題上,對(duì)于牛、羊等家畜則主要集中在肉質(zhì)改善問(wèn)題上。本研究通過(guò)克隆徐淮山羊PPARγ基因,進(jìn)行體外表達(dá)、亞細(xì)胞定位研究,在細(xì)胞水平上進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證,最后通過(guò)睪丸注射法介導(dǎo)PPARγ基因制備轉(zhuǎn)基因綿羊。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1.PPARγ基因的克隆、序列分析及重組真核表達(dá)載體構(gòu)建。設(shè)計(jì)合成PPARγ

3、基因特異性引物,采用RT-PCR方法克隆出徐淮山羊脂肪組織中PPARγ基因cDNA。將PPARγ基因擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD19-T Vector中,酶切與測(cè)序結(jié)果表明pMD19-T-PPARγ構(gòu)建正確。然后將PPARγ基因以融合表達(dá)方式克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-PPARγ,酶切與測(cè)序結(jié)果均表明pEGFP-PPARγ構(gòu)建正確。序列分析結(jié)果表明,徐淮山羊PPARγ基因cDNA序列與雞、小鼠、豬、牛及

4、綿羊在該基因相應(yīng)編碼區(qū)的同源性分別為81％、89％、92％、98％、99％;PPARγ基因氨基酸序列與雞、小鼠、豬、牛及綿羊的氨基酸同源性分別為92.9％、97.3％、98.3％、99.6％、99.8％,不同物種間的PPARγ有很高的保守性。
　　 2.體外重組PPARγ基因的表達(dá)及其亞細(xì)胞定位研究。用脂質(zhì)體介導(dǎo)融合表達(dá)載體pEGFP-PPARγ轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞系,48h后直接在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光在細(xì)胞中的位置,

5、同時(shí)提取細(xì)胞總RNA與總蛋白。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)、RT-PCR以及Western Blotting方法鑒定該融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明PPARγ蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。熒光倒置顯微鏡下觀察,重組PPARγ熒光蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)無(wú)熒光,同時(shí)在NIH-3T3細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了PPARγ基因的融合表達(dá),融合蛋白大小約為80kDa,為建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及制備轉(zhuǎn)基因羊奠定基礎(chǔ)。
　　 3.PPARγ基因表達(dá)誘導(dǎo)NIH-

6、3T3成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-PPARγ轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞系,經(jīng)G418篩選15～20d獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞系。然后添加成脂誘導(dǎo)劑(5ug/ml胰島素、1uM地塞米松和0.5uM羅格列酮)誘導(dǎo)15d左右,采用油紅O染色法鑒定,并通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。結(jié)果表明,誘導(dǎo)5d左右,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)脂滴,位于細(xì)胞核周圍,8～15d左右出現(xiàn)脂滴的細(xì)胞數(shù)增多,誘導(dǎo)率達(dá)30％;并且能夠檢測(cè)到脂肪特異性

7、基因——脂蛋白酯酶基因(LPL)mRNA的表達(dá),LPL mRNA大小約為1500bp。本研究在體外成功地建立了由PPARγ誘導(dǎo)NIH-3T3成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的模型,為進(jìn)一步研究PPARγ誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.攜帶PPARγ轉(zhuǎn)基因綿羊的制備及檢測(cè)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將線性化的重組質(zhì)粒pEGFP-PPARγ通過(guò)隨機(jī)打點(diǎn)注射入性成熟的湖羊睪丸內(nèi)。首次注射1周后重復(fù)注射1次,并于轉(zhuǎn)染40d后使其與正常