煙草NtWRKY6基因的克隆與表達(dá)模式分析.pdf

1、植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常受到生物和非生物脅迫因素的影響，為了適應(yīng)逆境條件，植物已經(jīng)進(jìn)化出一套復(fù)雜的、綜合的調(diào)控系統(tǒng)，在此系統(tǒng)中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中包括調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)外界不良環(huán)境。WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學(xué)功能，是植物特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對(duì)植物的逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成等生理過(guò)程起著重要的作用。目前在擬南芥、水稻、大豆和小麥等植物中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與植物生物脅迫研究取得了重要的進(jìn)展，

2、然而在煙草中與逆境脅迫相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究報(bào)道較少。本研究克隆了煙草中的一個(gè)WRKY家族成員，并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析。主要研究如下:
　　(1)利用同源性克隆方法，從野生煙草NaWRKY6同源克隆NtWRKY6基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析，表明該基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度為1647bp，編碼548個(gè)氨基酸，有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，屬于第Ⅰ類WRKY蛋白。與辣椒、番茄的WRKY基因序列同源性87％以上。同源性分析表明克隆

3、的基因與擬南芥轉(zhuǎn)錄因子基因AtWRKY6有較高的同源性，與NtWRKY1序列同源性為97％，因此我們推測(cè)其可能為NtWRKY6。
　　(2)構(gòu)建NtWRKY6基因的pGBKT7載體，轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，結(jié)果表明該轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　(3)通過(guò)半定量RT-PCR對(duì)NtWRKY6基因進(jìn)行非生物脅迫響應(yīng)的情況分析表明:在低鉀脅迫下，3h內(nèi)Nt WRKY6的表達(dá)量高，3h后表達(dá)量開(kāi)始降低，12h后表達(dá)量趨于穩(wěn)定。說(shuō)明

4、NtWRKY6能響應(yīng)低鉀脅迫;NtWRKY6在低磷處理12h后表達(dá)量增加，24h表達(dá)量更高，說(shuō)明NtWRKY6在低磷脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá);NtWRKY6在鹽脅迫3h后表達(dá)量增加，12h后達(dá)到穩(wěn)定水平，說(shuō)明NtWRKY6受鹽脅迫的誘導(dǎo);在10％PEG模擬干旱脅迫處理下，NtWRKY6在0～24h表達(dá)量差異不顯著。
　　(4)構(gòu)建NtWRKY6-pBI121過(guò)表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404中，通過(guò)菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。采用葉盤