甘露糖化咪唑化羧甲基殼聚糖與依替膦酸復合物納米粒在動物體內(nèi)抗腫瘤效應的初步研究.pdf

1、目的:本研究采用皮下種植H22肝癌細胞的方法制作Balb/c小鼠腫瘤模型，并采用免疫組化法觀察模型小鼠中腫瘤組織的TAMS聚集情況。前期研究中已發(fā)現(xiàn)的甘露糖化殼聚糖納米粒具有與甘露糖受體特異性結(jié)合的能力，在本研究初步了解納米藥物在小鼠體內(nèi)的安全劑量，評價該納米藥物在模型小鼠的組織分布、對模型小鼠的抑瘤效果，進一步在細胞水平探討該納米顆?？鼓[瘤的作用機制。
　　方法:1、模型小鼠的制作:將H22肝癌細胞注入balb/c小鼠腹腔，取腹

2、水離心后生理鹽水重懸1×107/ml，移植于小鼠左側(cè)腹股溝皮下，每只0.2ml，皮下形成腫瘤的小鼠即為模型小鼠。2、模型小鼠癌巢周圍巨噬細胞聚集情況:采用免疫組化染色方法，用CD68抗體、CD163抗體分別標記腫瘤病灶的腫瘤相關(guān)巨噬細胞TAMS、M2型巨噬細胞，在光學顯微鏡觀察腫瘤組織陽性染色細胞的聚集情況。3、納米藥物的安全劑量實驗:設(shè)計三個梯度的納米藥物實驗組，尾靜脈注射納米藥物濃度分別為:1g/kg、500mg/kg、200mg/

3、kg，生理鹽水組為對照組，給藥后7天內(nèi)記錄小鼠的有無死亡，觀察小鼠的飲食、活動及體重變化情況，評價安全性，尋找后期實驗的用藥劑量。4、納米藥物在模型小鼠體內(nèi)的組織分布:模型小鼠分別在尾靜脈推入納米藥物后3小時、24小時、72小時剖出心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，行快速冰凍切片，通過熒光顯微鏡觀察組織中熒光強弱并記錄熒光值。5、納米藥物的抑瘤實驗:實驗設(shè)計高、中、低濃度納米藥物實驗組(MICE)，生理鹽水組和空白納米組做為陰性對照組，干擾素組

4、為陽性對照組，移植后第二天予不同藥物處理，在用藥后21天內(nèi)記錄各組小鼠腫瘤生長的體積變化。實驗結(jié)束，剖檢各組剩余小鼠的腫瘤，稱重和測量體積，并計算各組小鼠的腫瘤體積抑制率和腫瘤質(zhì)量抑制率。重復實驗，記錄在用藥后30天內(nèi)各組小鼠的存活數(shù)量。6、納米藥物對癌巢中免疫細胞影響:實驗設(shè)計了納米藥物組、干擾素組、空白納米顆粒組、生理鹽水組，移植后第二天予不同藥物處理，皮下種植模型后15天實驗結(jié)束，眼底靜脈采血并剖出小鼠的腫瘤組織，腫瘤組織用機械法

5、制作單個細胞，通過流式細胞儀檢測靜脈血和腫瘤組織中CTL、Treg、M1、M2型巨噬細胞的比例。
　　結(jié)果:1、小鼠在皮下種植后第8天，捫及有腫瘤形成，表明模型建立成功。2、腫瘤免疫組化結(jié)果:腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)均有TAMS和M2型巨噬細胞聚集，其中腫瘤間質(zhì)聚集的TAMS、M2型巨噬細胞多于腫瘤實質(zhì)。3、動物的藥物安全劑量實驗結(jié)果:在7天的觀察期間，三個濃度梯度的納米藥物實驗組的一般情況可，未觀察到明顯藥物毒性。剖檢實驗組和對照組小鼠的

6、重要臟器，臟器的顏色、形態(tài)均無明顯差別，藥物的安全性較好，提示后期實驗的用藥劑量在1g/kg以內(nèi)。4、納米藥物在模型小鼠的組織分布結(jié)果:心臟在用藥后3小時、24小時、72小時和空白對照組的熒光值相近，無統(tǒng)計學意義。用藥后3小時的肝、脾、肺、腎、腫瘤平均熒光值均大于對應的空白對照組(P＜0.01);用藥后24小時，只有肝、腎、腫瘤的平均熒光值高于空白對照組(P＜0.01);用藥后72小時，僅腫瘤的平均熒光值高于空白對照組(P＜0.01)。

7、5、納米藥物的抑瘤實驗結(jié)果:高濃度納米組的成瘤時間晚于其他五組，成瘤后各組小鼠腫瘤體積變化有明顯差異，其中高濃度納米組瘤體生長緩慢，其余五組腫瘤生長速度較快。實驗結(jié)束時，高濃度組腫瘤體積明顯小于其他五組(P＜0.01)。高濃度納米組的腫瘤體積抑制率和腫瘤質(zhì)量抑制率較高，可達到80％以上;其他五組的腫瘤體積抑制率和腫瘤質(zhì)量抑制率相差不大，均低于30％。實驗期間，高濃度納米組零死亡，其他組均出現(xiàn)模型小鼠死亡事件，提示高濃度納米藥物對腫瘤的抑

8、制效果明顯。6、流式細胞儀檢測結(jié)果:腫瘤組織檢測結(jié)果:與生理鹽水組對比，納米藥物組的免疫抑制性細胞M2和Treg比例下降，免疫增強的細胞M1和CTL細胞比例升高。干擾素組的免疫抑制性細胞Treg和M2比例升高，免疫增強的細胞CTL細胞比例升高、M1降低;空白納米組與生理鹽水的免疫細胞比例相近。靜脈血檢測結(jié)果:與生理鹽水組對比，納米藥物組的免疫抑制性細胞Treg比例升高、M2相近，免疫增強的細胞M1和CTL比例升高;干擾素組的免疫抑制性細

9、胞Treg比例升高、M2相近，免疫增強的細胞M1和CTL比例升高;空白納米組的免疫抑制性細胞Treg比例升高、M2相近，免疫增強的細胞CTL比例升高、M1降低。
　　結(jié)論:1、模型小鼠腫瘤組織中聚集有大量的TAMS、M2型巨噬細胞，具備腫瘤免疫治療的動物模型條件;2、納米藥物的安全劑量范圍至少在1g/kg以內(nèi);3、納米藥物能夠靶向聚集到腫瘤組織，且維持時間較長;4、高濃度納米藥物(500mg/kg)對腫瘤生長有明顯的抑制效果;5、