甘露糖化殼聚糖納米粒與腫瘤組織結(jié)合能力的研究.pdf

1、目的:采用免疫組化染色的方法觀察肝癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌病理標(biāo)本中腫瘤及正常組織中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞相關(guān)受體表達(dá)情況，進而了解以上細(xì)胞的數(shù)量;尋找一種相對簡便、經(jīng)濟、穩(wěn)定的甘露糖化殼聚糖粒制備流程和方法;利用TAMS、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)豐富的甘露糖受體，以及甘露糖化殼聚糖納米粒能與甘露糖受體特異性結(jié)合的原理，在肝、乳腺、胃、大腸的組織切片中觀察和評價甘露糖化殼聚糖粒與腫瘤組織的結(jié)合能力，從

2、而探求一種腫瘤的靶向治療新靶點與新方法。
　　方法:收集結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌及肝癌各50例患者的組織切片，每例患者組織切片均包含有腫瘤及正常組織，腫瘤組織組為觀察組，正常組織組為對照組，通過運用免疫組化的方法對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物CD68、CD163進行染色，在光鏡鏡視野下對表達(dá)為黃褐-深褐色的陽性染色細(xì)胞進行計數(shù)，評價TAMs、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞在各類腫瘤組織、正常組織中所占的比例;采用離子交聯(lián)法構(gòu)建出不同粒徑

3、大小甘露糖化殼聚糖納米粒，取19mg殼聚糖并配置成為濃度4mg/ml的溶液，在其中加入1％的冰醋酸，在室溫下攪拌4h，至溶液清澈。配置0.5mol/L氫氧化鈉溶液，將殼聚糖溶液的PH值調(diào)至6.23，加入5mg甘露糖于殼聚糖溶液中;反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)使用0.5mol/L氫氧化鈉溶液滴加入合成溶液中，有大量沉淀析出，轉(zhuǎn)移至試管中，3000rpm/min離心，去掉上清后，依次使用蒸餾水，甲醇，乙醇洗滌2次，最后得到固體沉淀。使用蒸餾水將得到的固體

4、沉淀完全溶解后，放入透析袋（截留分子量800），清水透析24小時，再將所剩的溶液倒出培養(yǎng)皿中，進行冷凍干燥2天。所獲得產(chǎn)物即為成功枝節(jié)甘露糖的殼聚糖。取100mg制作好的甘露糖化殼聚糖干粉，將其溶解在蒸餾水中，配置成為濃度1mg/ml的溶液，并使用0.5mol/L的氫氧化鈉溶液將該溶液的PH調(diào)至7.48;在30℃水浴條件下配置濃度為4mg/ml的ZOL溶液，ZOL按質(zhì)量比1∶3加入甘露糖化殼聚糖溶液中，室溫下攪拌30分鐘，將得到的合成產(chǎn)

5、物分別放入透析袋（截留分子量800）中，清水透析24h，透析后所得的溶液進行冷凍干燥2天。所得產(chǎn)物即為甘露糖化殼聚糖納米顆粒。利用熒光染料FITC結(jié)構(gòu)中的異硫氰基與甘露糖化殼聚糖納米粒中的伯胺基反應(yīng)，生成對應(yīng)的取代硫脲，并用熒光掃描檢測其熒光繼發(fā)波長及最大吸收波長。在激光粒度分析儀下測量粒徑大小;利用納米粒攜帶的甘露糖與腫瘤組織里面TAMs細(xì)胞表達(dá)的甘露糖受體可以特異性結(jié)合的原理，將腫瘤石蠟組織切片經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)以后，加入適當(dāng)比例的

6、不同粒徑甘露糖化殼聚糖納米粒PBS懸濁液，37℃孵育過夜，棄溶液，PBS溶液沖洗，冷凍干燥。在熒光顯微鏡下觀察腫瘤組織及正常組織與納米粒的結(jié)合情況，觀察熒光染色細(xì)胞的分布以確定其結(jié)合位置，通過陽性染色細(xì)胞計數(shù)可反映出兩者結(jié)合能力的大小。最后對免疫組化結(jié)果做t檢驗統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，其中將CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量視為TAMs數(shù)量，CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量視作M2巨噬細(xì)胞數(shù)量，M1巨噬細(xì)胞數(shù)量由TAMs與M2巨噬細(xì)胞數(shù)量的差值計算得出;對免疫熒光染

7、色結(jié)果做Fisher精確檢驗統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:以每高倍鏡下陽性染色細(xì)胞數(shù)量判斷免疫組化表達(dá)陽性強度，觀察到以CD68為陽性標(biāo)記的TAMs大量表達(dá)于人乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌癌巢、癌周組織中的細(xì)胞膜上，在乳腺、胃、大腸的正常對照組織中僅有少量表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;而肝癌組織切片TAMs表達(dá)數(shù)量顯著少于正常肝組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以CD163為陽性標(biāo)記的M2巨噬細(xì)胞在受體于乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌的癌周細(xì)胞膜、胞漿中有大

8、量表達(dá)，在正常組織中極少表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;肝癌組織切片中M2巨噬細(xì)胞表達(dá)數(shù)量略多于正常肝組織，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。計算得出的肝、乳腺、胃、大腸腫瘤組織M1巨噬細(xì)胞數(shù)量均顯著多于正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用離子交聯(lián)法成功制備出粒徑在0.05um-1um的甘露糖化殼聚糖納米粒，其理化性質(zhì)穩(wěn)定。甘露糖化殼聚糖納米粒對組織病理切片及正常切片進行結(jié)合處理后觀察，癌巢、腫瘤周圍5HP/每片，并對免疫熒光染色的細(xì)胞進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)各腫瘤

9、組織觀察組和正常組織對照組在納米粒免疫熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)量差異顯著，腫瘤組織免疫熒光染色程度均高于正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞廣泛表達(dá)于肝癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌的癌組織中。其中M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞在乳腺、胃、大腸腫瘤組織切片中的表達(dá)數(shù)量顯著多于正常組織;M1巨噬細(xì)胞在肝腫瘤組織中的表達(dá)數(shù)量顯著多于正常肝組織，M2巨噬細(xì)胞在肝腫瘤組織表達(dá)數(shù)量與正常肝組織無明顯差異。M2型巨噬細(xì)胞在腫