糖基化終產(chǎn)物對心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響.pdf

1、晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycaton end products，AGEs)是人體內(nèi)的糖類（如葡萄糖）和蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)的游離氨基端通過一系列復雜的非酶促反應形成的結(jié)構(gòu)多樣的不可逆聚合物，加速了多種生物學進程，如糖尿病，炎癥反應，腎衰竭和老齡化。抗糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycationendproducts，RAGE)是細胞膜上識別糖基化產(chǎn)物的特異性受體，并在包括心臟的多種器官

2、中表達。多種病程中糖基化產(chǎn)終產(chǎn)物和糖基化終產(chǎn)物受體的結(jié)合促發(fā)了氧化應激種類，上調(diào)炎癥通路和RAGE介導的信號轉(zhuǎn)導機制的快速產(chǎn)生。近來研究表明心臟組織內(nèi)堆積的糖基化終產(chǎn)物和AGE-RAGE的相互作用是糖尿病心肌病的發(fā)病機理。并發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病的一個顯著表現(xiàn)是心肌收縮功能的失調(diào)，但其發(fā)生機制還不清楚。
　　鈣在心肌細胞興奮收縮偶聯(lián)過程中發(fā)揮著最基本的作用。在哺乳動物心臟中，促發(fā)心肌收縮的鈣主要來源于肌質(zhì)網(wǎng)。心肌收縮時，心肌細胞去極化，

3、細胞膜上電壓敏感的鈣通道被激活開放，細胞外鈣進入細胞內(nèi)，并激活肌質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣釋放鈣通道，使得肌質(zhì)網(wǎng)的丐庫釋放大量鈣轉(zhuǎn)到細胞質(zhì)內(nèi)，從而使胞質(zhì)內(nèi)自由鈣濃度快速升高而引發(fā)心肌收縮。
　　RyR是肌質(zhì)網(wǎng)膜上的一種鈣離子釋放通道，它是肌漿網(wǎng)上通過鈣誘導鈣釋放機制（Ca2+-induced-Ca2+-release，CICR）釋放鈣的門控。鈣火花是由4-6個相鄰的RyRs共同釋放鈣而發(fā)生的，是細胞內(nèi)鈣釋放的基本單位，控制著肌質(zhì)網(wǎng)的鈣容量。舒張

4、期時，RyR的活性決定了隨機性鈣火花的發(fā)生。以往研究表明，RyR功能異常導致的心功能失常是引起多種疾病發(fā)生的原因，如局部缺血再灌注，心肌肥大和心衰。在心肌局部缺血中，超活躍的RyR2增強舒張期的鈣泄漏，參與室性心律失常、心肌梗死和左心室損傷中的心肌重構(gòu)。在心衰時，增強的肌質(zhì)網(wǎng)鈣泄漏使得SR鈣容量的部分耗竭，從而損傷心肌收縮功能及導致室性心律失常。
　　AGE-RAGE的相互作用通過減少收縮和舒張時細胞內(nèi)鈣離子的濃度及延長鈣瞬變衰減

5、的時間而損害了心肌細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。眾所周知，RyR2因其表面富含自由巰基而被認為是細胞氧化還原傳感器，通過加強細胞內(nèi)氧壓，可增強RyR的活性和肌漿網(wǎng)鈣的泄漏。因為AGE/RAGE信號可引發(fā)氧自由基產(chǎn)物的產(chǎn)生，以此我們進行假設，AGE/RAGE是通過增強RyR的活性，導致肌質(zhì)網(wǎng)鈣漏增加，從而損害心肌細胞的鈣穩(wěn)態(tài)。在本研究中，我們對AGE/RAGE引發(fā)心肌細胞膜上RyR活性增強的假設進行驗證。并進一步闡述強活性的RyR調(diào)控肌質(zhì)網(wǎng)鈣漏，減少肌

6、質(zhì)網(wǎng)鈣庫容量，最終導致收縮時鈣瞬變減少的機制。
　　目的:晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)加速了糖尿病的發(fā)展，同時糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)在糖尿病心臟病的病程進展中起到了重要的作用。本研究在于探討AGE/RAGE對大鼠心肌細胞肌漿網(wǎng)上RyR活性與鈣穩(wěn)態(tài)的影響，從而闡明糖尿病心肌病導致心功能失常的可能機制。
　　方法:南方醫(yī)科大學動物中心提供的SD乳鼠(2d)，用酶消化兩步法分離培養(yǎng)心肌乳鼠細胞，在本課題中，以乳鼠心肌細胞為研究

7、對象。并用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，分別記錄鈣火花、鈣庫、鈣瞬變等鈣信號指標。以觀察AGE對乳鼠心肌細胞鈣信號的影響。
　　結(jié)果:1.結(jié)果顯示，與正常組比較，50μg/ml組AGE顯著的增加鈣火花的頻率1.6倍，150μg/ml組的AGE僅僅只增加了53％，同時AGE降低鈣火花的幅度與寬度。用抗體阻滯RAGE可以完全抑制由AGE刺激引發(fā)的鈣火花的發(fā)生.我們通過測量咖啡因(20rmM)誘導的鈣瞬變(△F/F0)幅度來評估鈣庫容量。令人驚

8、奇的是50μg/ml的AGE的刺激降低鈣庫容量是輕微的，而150μg/ml的AGE的刺激則能夠顯著的降低鈣庫容。同時我們發(fā)現(xiàn)，在同時通過給予1HZ的場刺激情況下，50μg/ml的AGE的刺激對鈣瞬變的幅度沒有影響，相對比之下，150μg/ml的AGE的刺激能夠明顯降低鈣瞬變的幅度(△F/F0)。
　　2.抗RAGE抗體可以完全修復鈣庫容量和改善鈣瞬變。
　　3.AGE/RAGE增加細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生與增強RyR活性