TnMV HC-Pro蛋白自身互作及其與擬南芥編碼Rieske Fe-S蛋白的互作研究.pdf

1、蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)是馬鈴薯Y病毒屬(genus Potyvirus)的確定成員,其分離物UK1能侵染擬南芥導(dǎo)致葉片黃化、植株矮化,侵染本氏煙引起嚴(yán)重的花葉、畸形等癥狀。TuMV-UK1編碼的HC-Pro蛋白是癥狀決定因子,同時也是基因沉默的抑制子。為了更好的了解TuMV編碼HC-Pro蛋白的功能及其在寄主上的致病機理,本研究對該蛋白的自身互作及其與擬南芥寄主因子的互作進(jìn)行了深入研究。

2、　　 已報道馬鈴薯Y病毒屬成員編碼的HC-Pro蛋白自身可以發(fā)生相互作用,但采用酵母雙雜交系統(tǒng)研究報道的不同病毒參與HC-Pro自身相互作用的關(guān)鍵功能區(qū)域并不一致。根據(jù)前人已報道的HC-Pro蛋白功能區(qū),結(jié)合TuMV—UK1分離物的氨基酸序列,構(gòu)建5個HC-Pro基因缺失突變體,對HC—Pro蛋白自身互作的功能區(qū)進(jìn)行了分析。采用酵母雙雜交及雙分子熒光互補技術(shù)檢測了HC-Pro蛋白及其突變體在酵母、本氏煙及昆蟲細(xì)胞中的相互作用和共定位。

3、研究表明TuMV HC-Pro蛋白中間段和C-末端是參與互作的區(qū)域,且C-末端258個氨基酸與HC-Pro完整蛋白的相互作用最強,而HC-Pro蛋白N-末端與蚜傳相關(guān)的99個氨基酸不參與或僅有微弱的自身相互作用。雙分子熒光互補實驗在煙草細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中都檢測到不規(guī)則的黃色熒光聚集體,進(jìn)一步證實了HC-Pro蛋白存在相互作用。這些研究還表明HC-Pro以形成二聚體或多聚體的形式行使其功能。進(jìn)一步對TuMV—UK1編碼的HC-Pro蛋

4、白在煙草表皮細(xì)胞、原生質(zhì)體及昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行定位,熒光定位結(jié)果表明在煙草細(xì)胞質(zhì)中檢測到綠色熒光,且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有聚集的小點和聚集塊,說明這些部位都有HC-Pro蛋白的存在,HC-Pro的大量積累可能會破壞正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)。在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)也顯示HC-Pro的定位主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 在前期以HC-Pro蛋白為誘餌,利用酵母雙雜交從擬南芥cDNA文庫中篩選與HC—Pro互作的寄主因子的基礎(chǔ)上,對HC-Pro蛋白與篩選的寄主鐵硫蛋

5、白(RieskeFe/S)的相互作用作進(jìn)一步研究。序列分析表明,Rieske Fe/S蛋白具有一個跨膜結(jié)構(gòu),成熟蛋白N-端少數(shù)氨基酸呈松散的排列,而C-端序列的氨基酸則呈相對有序的卷曲的緊密結(jié)構(gòu)。酵母雙雜交及BiFC都證實了HC-Pro蛋白與Rieske Fe/S蛋白的相互作用。通過酵母雙雜交對HC-Pro蛋白與Rieske Fe/S全長蛋白及其互作的關(guān)鍵功能區(qū)進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明參與完整HC-Pro蛋白相互作用的是Rieske Fe/S

6、蛋白的成熟蛋白,Rieske Fe/S蛋白N-末端的信號肽區(qū)域并不參與與HC-Pro蛋白相互作用,而與成熟的Rieske Fe/S蛋白互作的是HC-Pro蛋白中間段和C-末端功能區(qū),HC-Pro蛋白N-末端與蚜傳相關(guān)的功能區(qū)并不參與或僅與Rieske Fe/S蛋白有微弱的自身相互作用。BiFC的結(jié)果顯示在本氏煙葉片細(xì)胞中HC-Pro蛋白與Rieske Fe/S蛋白相互作用的位點主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等區(qū)域,呈不規(guī)則片狀聚集。
　

7、　 為了明確HC-Pro蛋白的表達(dá)是否影響Rieske Fe/S蛋白的細(xì)胞定位,對RieskeFe/S蛋白的定位及其與HC-Pro蛋白的共定位進(jìn)行了研究。對RieskeFe/S蛋白的定位研究表明該蛋白主要分布在煙草表皮細(xì)胞膜上,細(xì)胞質(zhì)中,部分形成大的聚集體,最典型的是其在葉綠體邊緣形成點狀或塊狀的聚集。HC-Pro蛋白與Rieske Fe/S蛋白的共表達(dá)增強了Rieske Fe/S蛋白的表達(dá)量,但是對Rieske Fe/S蛋白的細(xì)胞定

8、位改變并沒有顯著影響。這可能與HC-Pro蛋白具有抑制子功能,能增強外源基因的表達(dá)有關(guān)。
　　 為了研究Rieske Fe/S蛋白在寄主植物中的功能,對編碼Rieske Fe/S蛋白的Pet C基因采用煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)介導(dǎo)其基因沉默,在擬南芥和煙草上都觀察到相似的褪綠,黃化、矮化,植株長勢弱,發(fā)育遲緩等現(xiàn)象。葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)

9、的測定表明Pet C基因沉默的擬南芥與僅受TRV侵染的健康擬南芥葉片相比其Fo值升高,而Fv/Fm降低,說明該基因沉默后,葉片葉綠素含量降低。半定量檢測結(jié)果顯示基因沉默的擬南芥植株中Pet C基因的mRNA量明顯減少,轉(zhuǎn)錄水平降低約在30％～70％左右。而TuMV-UK1侵染擬南芥后常表現(xiàn)葉片黃化、花葉,植株矮化等癥狀,癥狀的出現(xiàn)可能與細(xì)胞內(nèi)葉綠體的穩(wěn)定性下降、結(jié)構(gòu)破壞、葉綠素含量下降等因素相關(guān)。推測HC-Pro蛋白與Rieske Fe