人FOXA1蛋白的表達(dá)、純化及蛋白互作分析.pdf

1、叉頭框（Forkheadbox’ FOX)轉(zhuǎn)錄因子家族基因廣泛地分布于從酵母到人的各種真核生物中，構(gòu)成一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，其中在哺乳動物中就擁有40個(gè)以上成員，分別參與細(xì)胞分化、增殖、代謝及細(xì)胞凋亡等生理過程的調(diào)節(jié)。FOX家族蛋白有19個(gè)亞族，共同特點(diǎn)是含有進(jìn)化保守的、約100個(gè)氨基酸組成的叉狀(Forkhead) DNA結(jié)合域（DNA-binding domain，DBD)。目前，有關(guān) FOX家族蛋白的功能及分子機(jī)制已逐步成為免疫

2、學(xué)遺傳學(xué)醫(yī)學(xué)以及腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)。
　　轉(zhuǎn)錄因子FOXA1屬于FOX家族的FOXA亞家族，是 FOX家族最早被克隆的成員。人的FOXA1基因含有472個(gè)氨基酸。它的功能區(qū)域分為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)。它的DNA結(jié)合域通過結(jié)合DNA，激活或抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)還能參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控和新陳代謝的調(diào)節(jié)，在生物體發(fā)育及成熟的組織器官中均能發(fā)揮重要作用。FOXA1蛋白還可以和許多其它的蛋白發(fā)生相互作用。
　　為

3、確定轉(zhuǎn)錄因子FOXA1的互作蛋白，我們構(gòu)建了FOXA1的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化后獲得了人FOXA1的C端和N端蛋白片段，為尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎(chǔ)。本研宄中，我們提取人乳腺癌細(xì)胞MCF7的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此為模板擴(kuò)增FOXA1的C端、N端cDNA片段，分別并克隆進(jìn)帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-4T-l,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。雙酶切及測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿