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1、腫瘤嚴(yán)重威脅公眾健康,是世界范圍內(nèi)威脅導(dǎo)致死亡的主要原因。雖然對(duì)于癌癥發(fā)生機(jī)理的研究已取得極大的進(jìn)展,但若想徹底治療癌癥仍有很長(zhǎng)的一段路要走。
蛋白質(zhì)等生物大分子在許多疾病的發(fā)生和治療中發(fā)揮著重要作用,但是根據(jù)類藥五規(guī)則[1],通常認(rèn)為蛋白質(zhì)類藥物具有很差的滲透性。使得蛋白質(zhì)這類有治療價(jià)值但無(wú)細(xì)胞膜穿透性且易降解的親水性分子在細(xì)胞生物學(xué)、藥學(xué)等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用大大受到限制。長(zhǎng)久以來(lái)研究人員致力于探索將這些效應(yīng)分子導(dǎo)入活細(xì)胞
2、的有效方法。常用的方法有:物理方法,如電穿孔[2]、顯微注射[3]等;生物及化學(xué)方法,如洋地黃皂苷處理法[4]、成孔蛋白質(zhì)法[5]等;其他方法,如運(yùn)用免疫毒素等蛋白質(zhì)載體[6]、顆粒(如脂質(zhì)體)包裹法[7]和病毒載體[8]等。盡管這些方法各有優(yōu)勢(shì),但都存在分子導(dǎo)入率低、易造成細(xì)胞損傷甚至死亡、操作復(fù)雜和難于調(diào)控等問(wèn)題。
細(xì)胞穿膜肽(cell pnentrating peptides,CPPs)又稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein
3、 transductingdomain)、特洛伊肽(Trojan peptides)。通常含有5-30個(gè)氨基酸,與其他多肽不同的是,細(xì)胞穿膜肽可以通過(guò)無(wú)細(xì)胞特異性、受體介導(dǎo)自由地導(dǎo)入各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部,且不會(huì)造成細(xì)胞損傷。細(xì)胞穿膜肽的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來(lái)了曙光,在細(xì)胞生物學(xué)、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評(píng)價(jià)及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。目前公認(rèn)以細(xì)胞穿膜肽多聚精氨酸最為簡(jiǎn)單有效。
胞嘧啶脫氨酶(Cyt
4、osine Deaminase,CD)是自殺基因腫瘤治療中的典型代表。胞嘧啶脫氨酶可轉(zhuǎn)化無(wú)細(xì)胞毒性的前導(dǎo)藥物5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)為化療藥物5氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)。5氟尿嘧啶可通過(guò)抑制胸苷酸合成酶的活性阻斷DNA的復(fù)制繼而引起細(xì)胞凋亡。
本研究所用胞嘧啶脫氨酶,為來(lái)源于大腸桿菌的原核胞嘧啶脫氨酶及其突變體。此突變體在天然的原核胞嘧啶脫氨酶的第316位苯丙氨酸和
5、第317為天冬氦酸突變?yōu)榘腚装彼岷透拾彼帷M蛔兒蟮脑税奏っ摪泵缚娠@著提高對(duì)5氟胞嘧啶的轉(zhuǎn)化效率,表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑癌作用。
本實(shí)驗(yàn)在原pSUMO載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建pSUMO-R9-EGFP,將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后通過(guò)SDS-PAGE比較SUMO-EGFP及SUMO-R9-EGFP表達(dá)量及可溶性的差異。用Ni-NTA親和層析柱純化SUMO-R9-EGFP,并利用SUMOprotea
6、se I切去SUMO標(biāo)簽,最終獲得純度較高的R9-EGFP成熟蛋白。以HepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞,以EGFP為對(duì)照,利用流式細(xì)胞儀及激光共聚焦檢測(cè)R9-EGFP的穿膜效果,結(jié)果顯示獲得的成熟R9-EGFP可快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,并聚集于細(xì)胞核內(nèi),而EGFP無(wú)此功能。同時(shí)R9-EGFP的穿膜效率呈時(shí)間、劑量依賴性,可被肝素抑制。
在pSUMO-R9-EGFP質(zhì)粒EGFP的位置插入原核胞嘧啶脫氨酶及其突變體,成功表達(dá)并純化多聚精氨酸-
7、原核胞嘧啶脫氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶突變體等融合蛋白。以HepG2細(xì)胞及U251細(xì)胞為靶細(xì)胞,以單獨(dú)原核胞嘧啶脫氨酶為對(duì)照,利用MTT比色法檢測(cè)兩種融合蛋白的細(xì)胞毒活性。結(jié)果顯示兩種融合蛋白均具有細(xì)胞毒性,且突變體優(yōu)于天然的原核胞嘧啶脫氨酶,單獨(dú)原核胞嘧啶脫氨酶無(wú)明顯細(xì)胞毒性,差異極顯著。
以小鼠肝癌細(xì)胞H22為腫瘤動(dòng)物模型,皮下注射多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶突變體等融合蛋白,腹部
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