金葡菌骨科臨床分離株分子分型鑒定及RNAⅢ對γ-溶素的調(diào)控機制初探.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, SA），又稱金葡菌，是臨床感染的重要致病菌，在骨科感染病原菌中居首位。金葡菌造成的骨關(guān)節(jié)感染常反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，難以控制的骨髓炎(osteomyelitis，OM)是骨科的嚴(yán)重感染性疾病，其復(fù)發(fā)率高，持續(xù)時間長，骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，對患者造成巨大的身體和經(jīng)濟負擔(dān)。加強病原生物學(xué)研究，從而有效控制骨感染迫在眉睫。
　　病原生物學(xué)研究面臨最大的挑戰(zhàn)是同一種病原菌存在多種多樣的表

2、型，體現(xiàn)在基因組水平上也可有很大差異。金葡菌菌株之間的基因組序列差異高達22％，所展現(xiàn)的表型極為豐富。根據(jù)金葡菌7個看家基因的MLST分析，已發(fā)現(xiàn)的金葡菌ST型就有2957種（http://www.mlst.net/），金葡菌主要克隆ST型別在不同國家和地區(qū)流行不一，因此其致病性差異也很大，因此，對金葡菌骨科臨床分離株進行分子分型鑒定對于有效控制骨感染具有重要意義。
　　毒力因子(virulence factor)是細菌致病的重要

3、“武器”之一。金葡菌可產(chǎn)生50種以上毒力因子，引起各種各樣的疾病。γ-溶血素(以下稱γ-溶素，γ-hemolysin)是葡萄球菌產(chǎn)生的一種穿孔毒素(pore-forming toxins，PFTs)，PFTs根據(jù)其跨膜孔洞的二級結(jié)構(gòu)可以分為α螺旋PFTs和β桶狀PFTs，金葡菌可以分泌多種β-PFTs，包括α溶素、γ-溶素、殺白細胞素，通過在細胞膜上形成β桶狀孔洞，造成胞內(nèi)物泄漏及細胞殺傷;除了α-溶素只由單條多肽鏈構(gòu)成外，其他幾種β-

4、PFTs均需F和S組分協(xié)同發(fā)揮作用，γ-溶素、殺白細胞素的F和S組分分別為LukF和Hlg2、LukF和LukS。γ-溶素類似殺白細胞素，主要作用于人類和其他哺乳動物的血細胞等，從而在金葡菌的致病、免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用。
　　RNAⅢ在金葡菌毒力調(diào)控中具有重要作用[14]。RNAⅢ是金葡菌Agr群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)的組成成分，也是Agr系統(tǒng)關(guān)鍵的效應(yīng)分子。金葡菌Agr系統(tǒng)由RNAⅡ和RNAⅢ兩個相鄰的操縱子構(gòu)成，分別由P2、P3

5、啟動子控制轉(zhuǎn)錄。其中，RNAⅢ是由514個核苷酸構(gòu)成的小RNA分子，可形成14個發(fā)夾式莖環(huán)結(jié)構(gòu)，調(diào)控著細菌毒力基因的表達。幾乎所有分離自急性感染的臨床金葡菌株均可產(chǎn)生RNAⅢ?？赏ㄟ^直接的堿基配對方式正調(diào)控或負調(diào)控多種毒力因子的表達。目前已知的金葡菌RNAⅢ可以下調(diào)的分子包括SarH1、LytM、LtaS、寡肽透性酶等，可上調(diào)的分子有殺白細胞素、腸毒素、胞外蛋白酶、脂酶、尿素酶、mecA等。而γ-溶素是否受到RNAⅢ的調(diào)控尚不明確。

6、r>　　RNAⅢ對毒力因子的調(diào)節(jié)功能可能有一部分是通過控制rot(repressor of toxins)來實現(xiàn)的。rot由McNamara等利用轉(zhuǎn)座子突變庫篩選并鑒定為一個調(diào)控因子，可能參與金葡菌毒力因子譜的調(diào)節(jié)，是一個全局性調(diào)控因子。Boisset等的研究表明，rot表達受RNAⅢ的負調(diào)節(jié)。目前尚不清楚RNAⅢ、rot與γ-溶素之間的調(diào)控關(guān)系。
　　研究金葡菌毒力因子的調(diào)控機制及其變化規(guī)律對理解金葡菌強致病性，及尋找控制金葡菌

7、臨床感染的新策略具有重要的意義。本論文的研究內(nèi)容分為兩部分，第一部分以2013年9月至2015年9月從重慶西南醫(yī)院骨科收集的金葡菌株為研究對象并根據(jù)病歷分為OM組和非OM組，用mecA-femB雙重PCR法鑒定MRSA，并對其進行SCCmec、spa、MLST、agr分型并檢測各種毒力因子，評估兩組之間的分子類型，藥物敏感性和毒力因子分布差異，以鑒定與金黃色葡萄球菌OM發(fā)生率相關(guān)的潛在指標(biāo)。并在此基礎(chǔ)上，檢測和比較菌株耐藥譜。第二部分旨

8、在探討RNAⅢ調(diào)控γ-溶血素的分子機制:利用同源重組的原理分別敲除金葡菌Newman株的γ-溶血素、RNAⅢ、及Rot調(diào)節(jié)蛋白，得到Newman-Δγ、Newman-ΔRNAⅢ及Newman-Δrot敲除株，進一步采用q-PCR、western-blot來分析金葡菌RNAⅢ、Rot調(diào)節(jié)蛋白與γ-溶素之間的相互關(guān)系。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、金葡菌骨科臨床分離株的分子分型鑒定
　　我們將139株來源于重慶西南醫(yī)院骨科的

9、金葡菌分為OM組及非OM組，進行了spa、MLST和agr分型鑒定，并檢測了一系列相關(guān)毒力因子。
　　(1)MRSA菌株鑒定:用mecA-femB雙重PCR方法鑒定MRSA。結(jié)果顯示139株菌共有34株MRSA。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，OM組與非OM組之間MRSA菌株差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)spa分型:將139株臨床金葡菌進行spa分型，并對其結(jié)果進行匯總。結(jié)果139株菌株共有54種spa型別，主要型別有t189(17.27％

10、，24/139)和t437(14.39％，20/139)，這兩種型別占所有菌株的31.66％。在兩組中，t189和t437都是最主要的spa類型（10/60，16.7％和14/79，t189為17.7％; t437為8/60，13.3％和12/79，為15.2％）。
　　(3)MLST分型:MLST分型結(jié)果顯示:139株菌株分為33個型別，其中優(yōu)勢型別為ST188(18.70％，26/139)和ST59(15.83％，22/139

11、)。 OM組(ST3538)和非OM組(ST3539)分別鑒定了一個新ST。
　　(4)agr分型:結(jié)果顯示139株細菌中，共檢出agrⅠ型100株(71.94％)，agrⅡ型13株(9.35％)，agrⅢ型14株(10.07％)，agrⅣ型12株(8.63％)。agrⅠ組被確定為兩組中最常見型別（38/60，63.3％和62/79，78.5％），上述所有優(yōu)勢ST和spa型別金黃色葡萄球菌均屬于agrⅠ。agrⅢ/agrⅣ組與OM

12、發(fā)病呈正相關(guān)(p=0.0040)
　　(5)毒力基因及粘附基因檢測:139株菌種顯示24株pvl為陽性，陽性檢出率為18.2％。分析后發(fā)現(xiàn)pvl陽性菌株79.17％(19/24)來自O(shè)M患者，且病程較長。結(jié)果顯示，所有分離株均攜帶至少六種粘附相關(guān)和三種外毒素相關(guān)的毒力基因。
　　2、RNAⅢ調(diào)控γ-溶血素分子機制的初步探討
　　RNAⅢ是金葡菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的細胞內(nèi)效應(yīng)子，它是已知控制大量毒力基因表達的最大的調(diào)節(jié)RNA之

13、一。RNAⅢ調(diào)控金葡菌中α-溶血素，腸毒素，酯酶A等一系列毒素。RNAⅢ對毒力因子的調(diào)節(jié)功能可能有一部分是通過控制rot來實現(xiàn)的。目前尚不清楚RNAⅢ、rot與γ-溶素之間的調(diào)控關(guān)系。我們通過構(gòu)建RNAⅢ和rot的敲除株來研究其對γ-溶血素的調(diào)控機制。
　　(1)Newman-Δγ、Newman-ΔRNAⅢ和Newman-Δrot敲除株的構(gòu)建
　　采用PCR方法以金葡菌基因組為模板分別擴增出所需的目的基因（敲除基因5'端上游

14、600-1000bp，3'端下游600-1000bp），用酶切連接將目的基因克隆入大腸桿菌和金葡菌的穿梭質(zhì)粒PBT2中，構(gòu)建敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入金葡菌RN4220經(jīng)過修飾后，轉(zhuǎn)入Newman中，誘導(dǎo)、篩選出敲除菌株。
　　(2)q-PCR檢測RNAⅢ、rot在轉(zhuǎn)錄水平上對γ-溶血素的調(diào)控作用
　　采用q-PCR分別檢測γ-溶素基因A、B、C的表達水平。q-PCR結(jié)果顯示γ-溶素A/B亞基在ΔRNAⅢ中表達上調(diào)、γ-溶素C亞基在Δ

15、RNAⅢ中表達下調(diào)。因γ-溶素由A亞基和B亞基，B亞基和C亞基以4+4的形式組成八聚體構(gòu)成，當(dāng)C亞基下調(diào)時γ-溶素的組成受到到影響呈下調(diào)趨勢，但A、B上調(diào)的幅度遠遠高于C下調(diào)幅度，所以，當(dāng)RNAⅢ敲除后γ-溶素的轉(zhuǎn)錄水平是升高的，此結(jié)果表明，RNAⅢ在轉(zhuǎn)錄水平上負調(diào)控γ-溶素，rot在轉(zhuǎn)錄水平上正調(diào)控γ-溶素。
　　(3)western-blot檢測RNAⅢ、rot在翻譯水平上對γ-溶血素的調(diào)控作用
　　Western-bl

16、ot結(jié)果顯示，γ-溶素A亞基在ΔRNAⅢ敲除株中表達上調(diào)、γ-溶素B亞基在ΔRNAⅢ敲除株中表達上調(diào)、γ-溶素C亞基表達差異不明顯。而這三個亞基在Δrot敲除株中表達差異與野生株相比并不明顯。結(jié)果表明，在翻譯水平上，RNAⅢ負調(diào)控γ-溶素，rot對γ-溶素沒有明顯的調(diào)控作用。
　　綜上，我們將139株來源于重慶西南醫(yī)院骨科的金葡菌分為OM組及非OM組，進行分子分型，毒力因子檢測，agr分型，pvl檢測后，評估兩組之間差異，鑒定了與

17、金葡菌OM發(fā)生率相關(guān)的潛在指標(biāo)。本研究豐富了骨科金葡菌分子流行病學(xué)資料，為骨科金葡菌感染監(jiān)控提供了可靠依據(jù)。同時結(jié)合分子分型及耐藥特征，進一步探究其流行原因及耐藥機制，有助于加強對金葡菌感染的防控。對139株金葡菌進行毒力因子檢測后，確定了γ-溶素是普遍存在于金葡菌中的一種毒素，與細菌的型別之間并不存在相關(guān)關(guān)系。另一方面，我們成功敲除RNAⅢ、rot、γ-溶素基因，并采用q-PCR，western-blot在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上檢測了RNA