雞源魏氏梭菌的分離、鑒定及分子分型研究.pdf

1、為了掌握四川規(guī)模化養(yǎng)雞場魏氏梭菌的分布現(xiàn)狀，本試驗首先從四川省規(guī)?；u場無臨床病癥雞群的新鮮糞便、腸道內(nèi)容物等樣品中分離魏氏梭菌，然后進行分子分型研究，最后采用雙層平板法篩選對魏氏梭菌具有一定生物拮抗作用的有益菌株，為預防和治療雞魏氏梭菌病提供理論依據(jù)和試驗材料。 本試驗從四川省雅安、名山、雙流、德陽等地的規(guī)?；B(yǎng)雞場采集健康雞的新鮮糞便、腸道內(nèi)容物樣品共150份。通過比較1％葡萄糖血瓊脂、卡那霉素加卵黃CW瓊脂平板(CW平板)

2、、SPS平板、TSC平板、TSN平板5種培養(yǎng)基對50株糞便樣品中魏氏梭菌的分離狀況，發(fā)現(xiàn)TSC平板表現(xiàn)出對糞便樣品中的干擾菌具有很好的拮抗壓力，而在TSC平板上魏氏梭菌長勢良好，且形成典型易于分辨的菌落形態(tài)。最后選定TSC平板作為分離雞糞便樣品中魏氏梭菌的最佳選擇性培養(yǎng)基。采用TSC平板對全部150份樣品做魏氏梭菌分離，然后將分離到的菌株接種到紫牛乳培養(yǎng)基中，結(jié)合紫牛乳是否出現(xiàn)“爆裂發(fā)酵”特征，最終確定初步分離到8株雞源魏氏梭菌。

3、 將分離的菌株純化培養(yǎng)后，參照Yoo等實驗公布的引物進行多重PCR(multiplex-PCR)反應，對分離的菌株進行病原基因確認，同時對其作血清分型。結(jié)果8株菌均可擴增出1條400bp左右的特異性條帶，擴增產(chǎn)物測序結(jié)果和報道的α毒素序列完全一致。另外對大腸埃希氏菌、沙門氏桿菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌在相同的反應體系中進行擴增，沒有擴增出特異性產(chǎn)物，說明該方法具有較高的特異性。鑒定結(jié)果證實8株分離菌株為魏氏梭菌，且血清

4、型為A型。 把血清型相同的魏氏梭菌歸為同一組，利用廣泛存在于腸桿菌科的“ERIC”、“REP”重復序列設計引物，依照PCR后的指紋圖譜，進一步對屬于同一血清型的魏氏梭菌做亞型分類。按照菌株指紋圖譜相似率達到80％則判定為同一菌株的標準，ERIC-PCR將8株A型魏氏梭菌分為5個亞型，REP-PCR分為3個亞型?？梢姸嘀匦蛄蠵CR反應能夠?qū)ξ菏纤缶膩喰妥鲇行Х诸?，比較兩種重復序列反應，ERIC-PCR對魏氏梭菌亞型分類具有更好效