雞源魏氏梭菌的分離、鑒定及分子分型研究.pdf

1、為了掌握四川規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)魏氏梭菌的分布現(xiàn)狀，本試驗(yàn)首先從四川省規(guī)?；u場(chǎng)無臨床病癥雞群的新鮮糞便、腸道內(nèi)容物等樣品中分離魏氏梭菌，然后進(jìn)行分子分型研究，最后采用雙層平板法篩選對(duì)魏氏梭菌具有一定生物拮抗作用的有益菌株，為預(yù)防和治療雞魏氏梭菌病提供理論依據(jù)和試驗(yàn)材料。 本試驗(yàn)從四川省雅安、名山、雙流、德陽等地的規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)采集健康雞的新鮮糞便、腸道內(nèi)容物樣品共150份。通過比較1％葡萄糖血瓊脂、卡那霉素加卵黃CW瓊脂平板(CW平板)

2、、SPS平板、TSC平板、TSN平板5種培養(yǎng)基對(duì)50株糞便樣品中魏氏梭菌的分離狀況，發(fā)現(xiàn)TSC平板表現(xiàn)出對(duì)糞便樣品中的干擾菌具有很好的拮抗壓力，而在TSC平板上魏氏梭菌長勢(shì)良好，且形成典型易于分辨的菌落形態(tài)。最后選定TSC平板作為分離雞糞便樣品中魏氏梭菌的最佳選擇性培養(yǎng)基。采用TSC平板對(duì)全部150份樣品做魏氏梭菌分離，然后將分離到的菌株接種到紫牛乳培養(yǎng)基中，結(jié)合紫牛乳是否出現(xiàn)“爆裂發(fā)酵”特征，最終確定初步分離到8株雞源魏氏梭菌。

3、 將分離的菌株純化培養(yǎng)后，參照Yoo等實(shí)驗(yàn)公布的引物進(jìn)行多重PCR(multiplex-PCR)反應(yīng)，對(duì)分離的菌株進(jìn)行病原基因確認(rèn)，同時(shí)對(duì)其作血清分型。結(jié)果8株菌均可擴(kuò)增出1條400bp左右的特異性條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果和報(bào)道的α毒素序列完全一致。另外對(duì)大腸埃希氏菌、沙門氏桿菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌在相同的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，沒有擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，說明該方法具有較高的特異性。鑒定結(jié)果證實(shí)8株分離菌株為魏氏梭菌，且血清

4、型為A型。 把血清型相同的魏氏梭菌歸為同一組，利用廣泛存在于腸桿菌科的“ERIC”、“REP”重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，依照PCR后的指紋圖譜，進(jìn)一步對(duì)屬于同一血清型的魏氏梭菌做亞型分類。按照菌株指紋圖譜相似率達(dá)到80％則判定為同一菌株的標(biāo)準(zhǔn)，ERIC-PCR將8株A型魏氏梭菌分為5個(gè)亞型，REP-PCR分為3個(gè)亞型?？梢姸嘀匦蛄蠵CR反應(yīng)能夠?qū)ξ菏纤缶膩喰妥鲇行Х诸悾容^兩種重復(fù)序列反應(yīng)，ERIC-PCR對(duì)魏氏梭菌亞型分類具有更好效