雞球蟲核酸疫苗的研究.pdf

1、雞球蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的一種寄生蟲病.目前主要靠藥物防治.近年來,由于球蟲耐藥性的產(chǎn)生及消費(fèi)者對綠色食品的呼喚,人們開始尋找其它的防治措施.核酸疫苗以其可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞,已在一些傳染病及腫瘤的防治上取得一定進(jìn)展.球蟲病對中國養(yǎng)禽業(yè)的危害也相當(dāng)嚴(yán)重,為了研究核酸疫苗對球蟲感染的防治效果,我們進(jìn)行了如下試驗(yàn):1.球蟲EtlA基因的克隆 以Eineria tenella BJ株孢子化卵囊總RNA為模板進(jìn)行RT-P

2、CR.按照GenBank發(fā)表序列合成引物,引物上下游加上BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn),以利于插入載體中.2.TA4基因的表達(dá)及鑒定 球蟲子孢子的表面抗原TA4(25kDa)是通過二硫鍵連接8kDa和17kDa兩條多肽形成的,在孢子化后期合成.E.tenella BJ株的TA4基因同國外株的同源性為99％.該試驗(yàn)進(jìn)行了TA4基因的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物免疫雞后,分離血清,以為DNA疫苗的檢測提供抗體.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以pGEX-KG為載體,用IP

3、TG可誘導(dǎo)TA4基因在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá).3.真核表達(dá)載體pCT和pCTE的構(gòu)建、體外表達(dá)及其對球蟲感染的防治效果研究 將TA4基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1中,然后在其上游融合方式插入E.tenella BJ株的EtlA基因,構(gòu)建成核酸疫苗pCDNA-TA4(pCT)和pcDNA-EtLA-TA4(pCTE),采用脂質(zhì)體介質(zhì)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞進(jìn)行體外表達(dá),并用IFAT檢測,均獲得成功.采用MTT法進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)

4、化試驗(yàn),表明中劑量(50μg)的pCT具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)雞的細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力.采用25％蔗糖局部胸肌預(yù)處理后10~15min,用核酸疫苗間隔一周兩次免疫雞,一周后采用3×10<'4>E.tenella BJ株孢子化卵囊攻蟲發(fā)現(xiàn),pCT和pCTE對球蟲感染具有明顯的保護(hù)作用,可顯著減輕球蟲感染引起的機(jī)體增重下降.其中,重組干擾素聯(lián)合核酸疫苗pCT中劑量(50μg)免疫時(shí),雞的增重效果最為明顯,相對增重率達(dá)到108.80％,盲腸病變值也最為輕