核酸疫苗免疫增強策略及其誘導免疫損傷的機制研究.pdf

1、核酸疫苗又稱基因疫苗、DNA 疫苗，是近年來隨著基因治療技術的發(fā)展而產生的一種新型疫苗，核酸疫苗和傳統(tǒng)疫苗相比有著顯著的優(yōu)勢，免疫后能夠同時誘導體液免疫和細胞免疫，不僅具有預防疾病的作用，同時還具有治療疾病的功效，所以治療性核酸疫苗成為近些年研究的重點。并迅速地從治療傳染性疾病的研究擴展到非傳染性疾病的研究，為乙型肝炎、囊蟲病等一系列感染性疾病的防治開辟了新的領域。盡管核酸疫苗得到了快速發(fā)展和廣泛的應用，但其總的免疫效果還存在一定的缺陷

2、。存在某些核酸疫苗在小動物實驗中免疫效果很好，但是在大動物實驗中效果不理想；有的核酸疫苗在動物實驗中能起到很好的免疫保護作用，但在臨床試驗中卻不能保護受試者抵抗病原體的侵害。如何提高核酸疫苗的免疫效果、闡述核酸疫苗的免疫機制成為核酸疫苗發(fā)展的核心問題。
　　 鑒于核酸疫苗的免疫原性低，近年來大量的研究嘗試通過新的免疫劑型、免疫方案等多種免疫策略來改善核酸疫苗的免疫效果。本課題通過使用DNA 疫苗的免疫新劑型微針注射輔以疫苗佐劑F

3、lt3L的方法來提高乙肝DNA 疫苗的免疫效果。通過我們的研究發(fā)現(xiàn)微針注射輔以細胞因子Flt3L 聯(lián)合免疫的策略，能明顯地增強乙肝DNA 疫苗體液免疫和細胞免疫。微針是在新型電子行業(yè)發(fā)展的基礎上衍生的新技術，通過氫氧化鉀腐蝕技術將化學聚合物、硅等焊接到1平方厘米的芯片上形成的聚合針列，其高度在50微米到200微米能夠有效穿透皮膚表層和角質層到達活性表皮層，而皮膚尤其是活性表皮富含抗原提呈細胞，一直被認為是高免疫活性部位，通過微針將核酸疫

4、苗靶向給藥于表皮層，可以直接作用與抗原提呈細胞從而提高免疫效果。Flt3L是近年來的被廣泛關注的一種免疫刺激分子，能夠增強T細胞依賴性和T細胞非依賴性2種途徑的T細胞的增殖。不僅如此Flt3L 還能夠誘導抗原提呈細胞DC的分泌和活化、在炎癥部位募集DC等抗原遞呈細胞。從不同免疫組合中我們比較得到微針介導細胞因子Flt3L能夠明顯的增強疫苗的體液免疫和細胞免疫水平。本課題系統(tǒng)地考察了這種新的免疫方案的免疫效果，并探討了其增效的分子機制。結

5、果表明微針介導細胞因子Flt3L 注射能夠顯著增強核酸疫苗的免疫原性，增強疫苗免疫效果。
　　 核酸疫苗的安全性問題也一直制約著核酸疫苗的發(fā)展，近年來有研究發(fā)現(xiàn)pcDNA3 負載的核酸疫苗誘發(fā)了實驗動物的自身免疫疾病，研究者對實驗動物解剖后發(fā)現(xiàn)了腎臟的病變，進一步深入的研究發(fā)現(xiàn)體內核酸疫苗持續(xù)產生的抗原抗體復合物的沉積誘發(fā)了腎小球基底膜病變。其確切機制仍不明了，此外，自然雜志上也報到了常用佐劑分子CpG 序列誘發(fā)實驗動物肝臟病變

6、的現(xiàn)象。核酸疫苗免疫原性低的問題限制了核酸疫苗的廣泛應用。為了提高免疫效果，大量的免疫策略被嘗試。CpG 序列是常用的佐劑分子，無論是pcDNA3 載體骨架上負載的CpG序列或者是寡核苷酸CpG 都可以起到都可以起到免疫增效的作用，然而是否CpG的使用存在某些安全隱患，需要進一步考證。多年來本課題組致力于核酸疫苗的機制研究，為了闡明核酸疫苗免疫誘發(fā)的不安全因素及其分子機制，我們以Pvax1、pcDNA3 質粒為載體構建了表達Annexi

7、nB1抗原的DNA 疫苗，對C57BL/6小鼠實施了3次免疫接種，通過檢測小鼠的總抗體滴度、T細胞增殖的能力、CTL活性來判斷核酸疫苗的免疫效果，研究結果表明，含有CpG 序列的pcDNA3-B1疫苗組的確誘導了更有效的免疫保護效果，但是在研究我們意外的發(fā)現(xiàn)pcDNA3-B1疫苗組誘發(fā)了局部黑色素丟失的免疫損傷現(xiàn)象，為了揭示這一免疫損傷的誘發(fā)因素和分子機制，本研究通過脾臟比較蛋白質組學的方法，尋找在免疫過程中發(fā)生改變的蛋白質，以這些顯著

8、改變的蛋白分子為橋梁尋找到核酸疫苗免疫后參與調控的信號通路，以期能闡明核酸疫苗誘發(fā)自身免疫病的分子機制。通過蛋白質組學的結果以及后續(xù)的生物信息學手段我們挑選了核酸疫苗組間差異顯著的5個蛋白，在pcDNA3-B1組顯著上調的2個蛋白和下調的3個蛋白，進一步通過文獻檢索、聚類分析以及功能分析確定了其中上調的一個蛋白growthfactor receptor bound protein 2的生理功能和pcDNA3能夠誘導更佳的免疫保護存在著潛

9、在的聯(lián)系，而下調蛋白中的2個蛋白proxiredoxin 1和proxiredoxin 6 屬于prdx蛋白家族成員，該家族成員的主要生理功能是在體內降解過氧化氫、超氧離子等反應活性氧，而體內反應活性氧和氧化應激的發(fā)生有著重要的關系，進一步的研究發(fā)現(xiàn)實驗動物體內proxiredoxin 6蛋白的下調導致體內反應活性氧的富集，進而誘發(fā)了體內氧化應激的產生最終激發(fā)自身免疫病的產生。通過本研究，我們闡明了核酸疫苗免疫誘發(fā)的相關疾病的分子機制，