增強(qiáng)核酸疫苗免疫效果的策略及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、核酸疫苗(DNA疫苗)是指將含有編碼抗原基因的真核表達(dá)載體直接接種體內(nèi)，在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生保護(hù)性免疫。核酸疫苗由于其獨(dú)特的雙免疫激活作用而受到越來(lái)越多的關(guān)注，有一些核酸疫苗已經(jīng)進(jìn)而Ⅱ期、Ⅲ期臨床研究，然而，核酸疫苗的免疫效果卻始終不甚理想，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于猴子、猩猩等大動(dòng)物，疫苗用量過(guò)大，為此，探索增強(qiáng)核酸疫苗免疫效果及降低疫苗用量的策略研究是十分必要的。 劑型改造是提高DNA疫苗免疫效果

2、的方法之一。本課題中探討了一種新型的DNA疫苗給藥系統(tǒng)，用聚乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA)包裹DNA疫苗形成微球疫苗后免疫小鼠，觀察免疫后小鼠體液免疫、細(xì)胞免疫及粘膜免疫的效果。實(shí)驗(yàn)中，以乙肝治療性DNA疫苗和多表位口蹄疫DNA疫苗為候選疫苗，應(yīng)用PLGA包裹形成微球疫苗，首先在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了疫苗微球?qū)乖f呈細(xì)胞的靶向作用。小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞被用于體外吞噬實(shí)驗(yàn)，模擬抗原遞呈細(xì)胞對(duì)疫苗抗原的攝取過(guò)程。通過(guò)姬姆薩染色，

3、證實(shí)了微球疫苗的可吞噬性；熒光標(biāo)記的疫苗微球的應(yīng)用，可以更準(zhǔn)確的動(dòng)態(tài)觀察微球的吞噬過(guò)程，在吞噬的2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)后分別收集細(xì)胞熒光顯微鏡觀察，可以看到隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀熒光逐漸融合，熒光強(qiáng)度逐漸增加，進(jìn)一步證實(shí)微球的可吞噬性。吞噬后的微球能否成功釋放疫苗，疫苗抗原能否正確表達(dá)?后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，在體內(nèi)、體外兩個(gè)層面上證實(shí)了抗原成份在抗原遞呈細(xì)胞中的正確表達(dá)。當(dāng)應(yīng)用PLGA包裹的乙肝DNA疫苗口服免疫小鼠后，可全面的激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免

4、疫和體液免疫，還可在局部引流淋巴結(jié)中觀察到疫苗抗原的表達(dá)，觀察到體現(xiàn)粘膜免疫效果的IgA的分泌，充分證實(shí)了口服乙肝DNA疫苗良好的免疫效果，獲得了有應(yīng)用前景的口服治療性乙肝DNA疫苗。在多表位口蹄疫DNA疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)，PLGA包裹可以降低疫苗的免疫劑量、減少疫苗的免疫次數(shù)，使新型口蹄疫DNA疫苗更廉價(jià)、使用更方便。 膜聯(lián)蛋白B1基因是本課題組以免疫篩選法從豬囊尾蚴cDNA文庫(kù)中得到的一個(gè)新基因，其基因產(chǎn)物是豬帶絳蟲(chóng)囊蟲(chóng)病的診

5、斷用抗原，也是很好的保護(hù)性抗原，以annexinB1為抗原基礎(chǔ)構(gòu)建的囊蟲(chóng)DNA疫苗，在豬的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中可保護(hù)仔豬免于蟲(chóng)卵沖擊后的感染或提高減蟲(chóng)率。對(duì)于一個(gè)高免疫原性的疫苗抗原，其結(jié)構(gòu)的解析、生物學(xué)活性的認(rèn)識(shí)是安全、有效的利用疫苗抗原的基礎(chǔ)，為了找到能更好的增強(qiáng)囊蟲(chóng)DNA疫苗免疫效果的新策略，本課題中構(gòu)建了annexinB1的結(jié)構(gòu)域突變體，對(duì)annexinB1及其突變體的生物學(xué)活性進(jìn)行了深入研究，對(duì)annexinB1的免疫佐劑作用機(jī)制進(jìn)行

6、了探討。實(shí)驗(yàn)中利用新的脂膜模型證實(shí)了annexinB1的磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合活性，激光共聚焦顯微鏡觀察了annexinB1與凋亡細(xì)胞的結(jié)合，放射性核素標(biāo)記的annexinB1顯像了小鼠肝細(xì)胞凋亡，從細(xì)胞水平和分子水平證實(shí)了annexinB1與PS的結(jié)合是特異性的、鈣依賴(lài)性的，從體外到體內(nèi)驗(yàn)證了annexinB1的細(xì)胞凋亡檢測(cè)活性，為將annexinB1開(kāi)發(fā)成為可用于體內(nèi)外凋亡檢測(cè)的探針蛋白奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本課題綜合分析了a

7、nnexinB1的生物學(xué)活性，結(jié)合核酸疫苗基礎(chǔ)理論研究的新進(jìn)展，探討了annexinB1作為核酸疫苗免疫佐劑的作用機(jī)制，初步分析是：PS分子是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性分子，可通過(guò)PS受體介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的清除，所以當(dāng)annexinB1特異性結(jié)合到早期凋亡的抗原遞呈細(xì)胞表面的PS分子時(shí)，封閉了凋亡信號(hào)分子，可抑制凋亡清除細(xì)胞對(duì)抗原遞呈細(xì)胞的攻擊，延長(zhǎng)抗原遞呈細(xì)胞在免疫局部和局部引流淋巴結(jié)中的存活時(shí)間，延長(zhǎng)疫苗抗原的表達(dá)和遞呈時(shí)間，增強(qiáng)疫苗的免疫原

8、性，起到免疫佐劑的作用。 總之，本論文的實(shí)驗(yàn)研究是圍繞如何提高DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)這個(gè)核心問(wèn)題開(kāi)展工作，選擇了DNA疫苗新劑型策略，制備了可口服的乙肝治療性DNA疫苗，并激發(fā)了特異性粘膜免疫；PLGA包裹的多表位口蹄疫DNA疫苗可在較低劑量、單次免疫的情況下獲得良好的免疫效果，大大方便了口蹄疫疫苗的應(yīng)用，降低了免疫成本。研究中還發(fā)現(xiàn)，annexinB1依其對(duì)凋亡細(xì)胞清除信號(hào)分子PS的結(jié)合活性，可延長(zhǎng)免疫局部抗原遞呈細(xì)胞的